转录因子Nrf2在香烟烟雾诱导粘蛋白MUC5AC表达中的作用

发布时间：2018-02-11 06:13

  本文关键词： 香烟烟雾 红细胞系统核因子相关因子2 粘蛋白MUC5AC　出处：《浙江大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景 香烟烟雾中含有大量的氧化剂、自由基和有机物基团，有些物质可以长期沉积在肺组织小气道中。香烟烟雾给肺组织带来持续的氧化物刺激，造成明显的氧化应急。长期吸烟的患者气道标志性的改变包括气道上皮杯状细胞化生和增生，导致粘液分泌增多。 气道熟液是不同成分分泌物的混合物，根据其特性分为凝胶形成蛋白和膜相关钻蛋白两大类。其中4种凝胶形成钻蛋白MUC2,MUC5AC、MUC5B及MUC19主要表达于气道中，由气道上皮的杯状细胞和粘膜下腺的粘液细胞分泌。气道中的粘液能够吸附一些颗粒和病原菌，以便通过纤毛上皮的纤毛运动予以清除。气道上皮细胞MUC5AC及MUC5B的分泌过度是引起支气管炎咳嗽咳痰症状的原因。无论是人类还是动物模型中，气道疾病如囊性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等如合并气道粘液过度分泌往往使得发病率和病死率进一步恶化 红细胞系统核因子相关因子2(nuclear factor erythroid2related factor2, Nrf2)是CNC转录因子家族成员中活力最强的转录调节因子，广泛表达于如肝脏、肾脏、肺等多种组织。Nrf2介导的抗氧化反应是一种主要的细胞防御机制。Nrf2缺失或激活障碍，可加重氧化应激源的细胞毒性，导致细胞功能障碍、凋亡甚至死亡。 目前尚无Nrf2在香烟烟雾诱导MUC5AC表达中作用的研究报导，我们希望通过本研究明确Nrf2在香烟烟雾诱导MUC5AC表达和气道炎症中的作用，并通过这一研究找到香烟相关的气道炎症、粘液分泌过度的新的治疗靶点。 研究内容 第一部分香烟烟雾溶液诱导A549细胞粘蛋白MUC5AC及核转录因子 Nrf2的表达 目的：1、制备稳定的香烟烟雾溶液；2、通过MTT法检测香烟烟雾溶液对A549细胞的毒性，确定后续实验需要的合适烟雾溶液浓度；3、通过烟雾溶液刺激A549细胞并检测Nrf2和MUC5AC的：mRAN和蛋白表达，为后续研究确定合适的烟雾干预时间和浓度。 方法：1、制备香烟烟雾溶液，以分光光度仪测定OD320,检测稳定性；2、通过MTT方法检测香烟烟雾溶液对A549细胞的毒性；3、不同时间香烟烟雾孵育A549细胞后以Q-PCR和WB方法分别检测Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表达。 结果：1、连续14天制备的香烟烟雾溶液OD320平均为0.7394,标准差0.05804,95%可信区间为0.7213-0.7575,单因素方差分析提示数据没有统计学差异（P0.05），提示该方法得到的数据一致性很好，该方法稳定。2、通过MTT法提示香烟烟雾溶液随着浓度的增高孵育时间延长，对A549细胞的抑制率增大。10%及以下浓度抑制率明显小于25%以上浓度。10%浓度烟雾溶液在48小时抑制率明显增高，孵育时间小24小时各时间点抑制率差别不明显.3、10%烟雾溶液孵育A549细胞可以促进Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表达，表达量随着时间的延长而增加，至24小时可以达到最高。 小结：1、本研究采用的香烟烟雾溶液方法得到的结果稳定，该溶液对人肺上皮样细胞A549体外有细胞毒作用，呈时间和浓度依赖性。2、香烟烟雾溶液可以诱导A549细胞粘蛋白MUC5AC的表达，这一作用在24小时内呈时间依赖性。3、香烟烟雾溶液可以诱导A549细胞核转录因子Nrf2的表达。 第二部分核转录因子Nrf2在香烟烟雾溶液诱导A549细胞粘蛋白MUC5AC表达中的作用 目的：1、验证抑制A549细胞Nrf2基因表达可以增加香烟烟雾诱导MUC5AC的作用；2、验证过表达A549细胞Nrf2基因表达可以减弱香烟烟雾诱导MUC5AC的作用；3、乙酞半胧氨酸对香烟烟雾诱导MUC5AC的作用有保护作用。 方法：1、以小干扰RNA抑制A549细胞Nrf2基因基础上，再以香烟烟雾溶液孵育A549细胞后分别以Q-PCR和WB方法检测Nrf2和MUC5AC的mRNA和蛋白表达；2、以pCDNA3-Myc3-Nrf2质粒过表达A549细胞Nrf2基因基础上，再以香烟烟雾溶液孵育A549细胞后分别以Q-PCR和WB方法检测Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表达；3、以乙酞半耽氨酸干预烟雾溶液对A549细胞的作用后，以Q-PCR方法分别检测Nrf2和MUC5AC的mRAN表达。 结果：1、小干扰RNA有效抑制Nrf2的表达，阴性对照小干扰RNA组CSE刺激后MUC5AC蛋白表达增加64.33%，干扰组CSE刺激后MUC5AC蛋白表达增加195.33%,是前者的三倍多，两者的差别有明显的统计学意义（P0.001)。2、pCDNA3-Myc3-Nrf2质粒可以有效促进Nrf2的表达，给予空质粒对照组烟雾诱导MUC5AC蛋白增高约47.44%,pCDNA3-Myc3-Nrf2过表达后，烟雾诱致MUC5AC蛋白增高约25.74%，过表达Nrf2可以使烟雾诱导MUC5AC蛋白的量下降45.73%,两者的差别有明显的统计学意义(p0.05).3,20mM NAC可以促进Nrf2mRNA表达，减弱烟雾溶液诱导A549细胞MUC5AC mRNA的表达。 小结：1、在以siRNA有效敲除A549细胞Nrf2基因后，香烟烟雾诱导的MUC5AC较未敲除前增加程度增加。2、在以pCDNA3-myc3-Nrf2质粒过表达A549细胞Nrf2基因后，香烟烟雾诱导的MUC5AC较未敲除前增加明显减少。3、N-乙酸半耽氨酸体外可以促进Nrf2基因表达，并可以减少香烟烟雾诱导MUC5AC的作用。 第三部分核转录因子Nrf2在香烟烟雾诱导小鼠气道炎症及肺组织粘蛋白MUC5AC表达中的作用 目的：1、验证Nrf2在香烟烟雾诱导小鼠气道炎症中的保护性作用。2、验证Nrf2在香烟烟雾诱导小鼠粘蛋白MUC5AC表达中的保护性作用 方法：1、分别给予正常ICR小鼠和Nrf2-/-ICR小鼠不同时间的短期(3、7和14天)熏烟后，通过无创气道反应性测定、支气管肺泡灌洗液细胞计数、肺组织病理切片炎症评分等方法明确香烟烟雾诱导的气道炎症及Nrf2在其中所起的作用。2、分别给予正常ICR小鼠和Nrf2-/-ICR小鼠不同时间的短期（3、7和14天）熏烟后，通过肺组织病理切片PAS染色、通过WB测定肺组织蛋白中Nrf2蛋白的含量以及通过ELISA的方法检测支气管肺泡灌洗液中MUC5AC蛋白含量来比较各组粘液及粘蛋白MUC5AC表达情况及与Nrf2的关系。 结果：1,短期熏烟后，正常ICR小鼠气道反应性均会增高，BLAF种细胞总数增加，中性粒细胞比例略增高，肺组织病理切片中炎症评分会升高，熏烟时间延长，以上改变更明显；敲除Nrf2后，以上现象变得更加明显。2、短期熏烟后，Nrf2-/-小鼠肺组织病理切片PAS评分明显高于相同时间熏烟的正常ICR组，BALF中MUC5AC蛋白含量随薰烟时间延长明显增高。 小结：1、短期香烟烟雾作用可以使Nrf2-/-小鼠表现为更明显的中性粒细胞为主的气道炎症及气道反应性明显增高。2、短期香烟烟雾作用可以使小鼠肺部粘蛋白MUC5AC表达增加，Nrf2-/-小鼠表现更加明显。 结论 1、香烟烟雾可以诱导粘蛋白MUC5AC表达，这一现象部分由转录因子Nrf2介导。 2、香烟烟雾可以提高小鼠气道炎症，敲除Nrf2会使炎症加重。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R114

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本文编号：1502383