甲醛染毒对人支气管上皮细胞炎性因子影响及作用机制研究

发布时间：2018-02-14 13:54

本文关键词： 甲醛细胞因子哮喘 Th1/Th2/Th17类细胞信号转导通路　出处：《济南大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：【目的】通过不同浓度甲醛染毒人支气管上皮细胞16HBE,检验甲醛对人支气管上皮细胞16HBE毒性,研究甲醛致哮喘机制中Th1/Th2/Th17类与TNF-α细胞因子间的变化规律与NF-κB、COX-2、JNK、ERK蛋白表达水平的影响,确定评估甲醛致哮喘作用及相关炎性因子生物标志物,探讨甲醛致哮喘作用机制。【方法】1、甲醛染毒人支气管上皮细胞16HBE增殖活性实验取对数生长期内细胞接种于96孔板上,在37°,5%CO2条件下培养至细胞单层铺满孔底,按实验要求分6组甲醛染毒24小时(甲醛染毒浓度分别为0.04、0.08、0.16、0.32、0.64mmol/l,用无血清1640培养基与甲醛分析纯配置),每个浓度设6个平行孔,用MTT法检测人支气管上皮细胞16HBE增殖活性并检测半数致死量LC50。2、人支气管上皮细胞急性甲醛染毒2、4小时后细胞上清液中Th1类细胞因子变化研究取对数生长期内16 HBE细胞接种于48孔板上,用无血清培养基、不同浓度甲醛溶液(用无血清培养基配至浓度为0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l)染毒后,在37°,5%CO2无菌培养箱内培养2、4小时后取细胞上清液高速离心后用ELISA试剂盒测Th1类细胞(IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ)因子含量研究人支气管上皮细胞急性甲醛染毒后Th1类细胞因子作用变化。3、人支气管上皮细胞急性甲醛染毒2、4小时后细胞上清液中Th2类细胞因子变化研究取对数生长期内16HBE细胞接种于48孔板上,用无血清培养基、不同浓度甲醛溶液(用无血清培养基配至浓度为0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l)染毒后,在37°,5%CO2无菌培养箱内培养2、4小时后取细胞上清液高速离心后用ELISA试剂盒测Th2类细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6、IL-13)含量研究人支气管上皮细胞急性甲醛染毒后Th2类细胞因子作用变化。4、人支气管上皮细胞急性甲醛染毒2、4小时后细胞上清液中Th17类与TNF-α细胞因子变化研究取对数生长期内16HBE细胞接种于48孔板上,用无血清培养基、不同浓度甲醛溶液(用无血清培养基配至浓度为0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l)染毒后,在37°,5%CO2无菌培养箱内培养2、4小时后取细胞上清液高速离心后用ELISA试剂盒测Th17(IL-8、IL-17)与TNF-α细胞因子含量研究人支气管上皮细胞急性甲醛染毒后Th17类及TNF-α细胞因子作用变化。5、用WESTERN BLOT法检测甲醛染毒后16HBE细胞信号转导通路蛋白NF-κB、COX-2、ERK表达变化取对数生长期内16HBE细胞接种于6孔板上,用无血清培养基、不同浓度甲醛溶液(用无血清培养基配至浓度为0.04、0.16、0.32、0.64、1.2 mmol/l)染毒后,在37°,5%CO2无菌培养箱内培养2、4小时后提取细胞总蛋白后用WESTERN BLOT法测NF-κB、COX-2、ERK的表达含量。【结果】1、人支气管上皮细胞(16HBE)的细胞存活率与甲醛染毒剂量成反比关系。与对照组(0mmol/l)相比,0.32、0.64mmol/l剂量组的细胞存活率下降明显,差异有统计学意义(P0.05)。甲醛对人支气管上皮细胞(16HBE)的半数致死量浓度为0.4658mmol/l。2、TH1类细胞因子检测结果显示:2小时甲醛染毒时,与对照组(0.00 mmol/l)相比,0.04、0.16mmol/l甲醛染毒剂量组细胞上清液中IL-2含量降低,差异均有统计学意义(P0.05),IFN-γ、IL-12组间变化均不明显,差异无统计学意义(P0.05);4小时甲醛染毒时,与对照组(0.00 mmol/l)相比,甲醛染毒剂量组内IL-2、IL-12含量下降,差异有统计学意义(P0.05);与对照组(0.00 mmol/l)相比,IFN-γ组间变化不明显差异无统计学意义(P0.05)。3、TH2类细胞因子检测结果显示:2小时甲醛染毒时,与对照组(0.00 mmol/l)相比,染毒剂量组细胞上清液IL-5含量升高,IL-6含量呈下降趋势,差异均有统计学意义(P0.05),IL-4、IL-10、IL-13组间变化不明显差异无统计学意义(P0.05);4小时甲醛染毒时,与对照组(0.00 mmol/l)相比,1.2mmol/l剂量组内IL-4含量升高,0.04、0.16、0.64剂量组内IL-5含量升高,1.2mmol/l剂量组内的IL-5含量降低、IL-6组间含量差异有统计学意义(P0.05),IL-10、IL-13组间变化不明显差异无统计学意义(P0.05)。4、TH17类与TNF-α细胞因子检测结果显示:2小时甲醛染毒时,与对照组(0.00mmol/l)相比,染毒剂量组细胞上清液内IL-8含量呈下降趋势,差异有统计学意义(P0.05),IL-17、TNF-α组间变化不明显差异无统计学意义(P0.05);4小时甲醛染毒时,经多因素方差分析,与对照组(0.00 mmol/l)相比,0.04、0.16mmol/l剂量组内IL-8含量升高,继续加大甲醛浓度后IL-8含量减少,各组间TNF-α含量均升高,差异有统计学意义(P0.05),IL-17组间含量变化不明显,差异无统计学意义(P0.05)。5、不同浓度的甲醛能明显上调核转录因子(NF-κB)、COX-2的蛋白表达水平,并在一定程度上呈现剂量反应关系,但是对甲醛对ERK蛋白含量的表达并无明显的影响【结论】1、低剂量的甲醛对人支气管上皮细胞增殖率有一定影响,当剂量加大时,会引起细胞死亡。2、急性甲醛染毒可降低Th1类IL-2、IL-12含量,升高Th2类IL-4、IL-5含量,升高Th17类IL-8含量,升高TNF-α含量,加重气道炎症,从而促进哮喘的发生发展。3、急性甲醛染毒可通过上调核转录因子(NF-κB)、COX-2、JNK、ERK的蛋白表达水平,促进炎性细胞的分泌,加重气道炎症。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114

【参考文献】