氯丙醇影响生殖的毒性机制初步研究

发布时间：2018-03-02 08:48

本文关键词： 3-氯-1 2-丙二醇 1 3-二氯-2-丙醇孕酮活性氧线粒体膜电位环腺苷酸类固醇激素合成急性调节蛋白　出处：《暨南大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：利用大鼠睾丸间质瘤细胞R2C、小鼠受精卵细胞和早期胚胎为实验对象，初步探索氯丙醇（chloropropanol，CP）两种主要形式，即3-氯-1,2-丙二醇（3-monochloropropane-1,2-diol，3-MCPD）和1,3-二氯-2-丙醇（1,3-dichloro-2-propanol，1,3-DCP）影响生殖的毒性机制探索。方法： MTT法检测CP对R2C细胞的生长影响和筛选CP实验浓度；原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）和单细胞电泳法（single cell gel electrophoresisassay，SCGE）观察细胞形态和DNA损伤作用；放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）检测细胞孕酮的合成和分泌状况；QRT-PCR法检测孕酮合成通路中关键基因StAR、P4C_(50)scc和3β-HSD mRNA水平；Western blotting法检测StAR和3β-HSD蛋白水平；流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）；化学发光法（chemiluminescence，CL）检测细胞内活性氧（reactie oxygen species，ROS）和环腺苷酸（cyclic adenosinemonophosphate，cAMP）的水平。体外受精检测小鼠卵母细胞碎裂率、受精率和受精卵早期胚胎发育状况。结果： 3-MCPD和1,3-DCP均可抑制R2C细胞生长。3-MCPD的IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)分别为1.027、1.802和3.160mM；1,3-DCP的IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)分别为1.161、1.897和3.100mM。AFM结果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C细胞24h，随着IC_(25)、ICC_(50)到IC_(75)刺激剂量的增加，细胞体积逐渐变小，外形由多边趋向椭圆，细胞膜的变化用平均粗糙度（Ra）、均方根粗糙度（Rq）和平均高度（Rpm）来量化分析。3-MCPD各刺激组（IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)）和对照组的Ra值分别为36.10±4.46nm、40.80±10.04nm、82.92±12.73nm和14.70±2.44nm；Rq值分别为45.72±4.838nm、C_(50).70±12.70nm、101.80±15.04nm和18.48±3.075nm；Rpm值分别为33.00±11.19nm、36.42±11.21nm、92.36±17.18nm和18.88±3.867nm。1,3-DCP各刺激组和对照组的Ra值分别为38.10±5.90nm、48.80±14.29nm、84.92±15.47nm和14.70±2.44nm；Rq值分别为51.98±6.35nm、60.08±13.25nm、108.5±7.47nm和18.48±3.075nm；Rpm值分别为35.00±11.52nm、46.42±13.72nm、100.4±18.54nm和18.88±3.867nm。以上各实验组与对照组之间进行两两比较，均有显著性差异（p＜0.05）。这些结果提示，3-MCPD和1,3-DCP对R2C细胞均有损伤作用。SCGE结果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C细胞4h，用尾部DNA含量、尾长和Olive尾距来量化刺激组DNA的损伤状况。3-MCPD各刺激组和对照组尾部DNA含量分别为10.243±1.073%、11.427±1.865%、18.984±1.640%和4.288±0.660%；尾长分别为17.429±1.913μm、19.333±1.647μm、29.167±2.332μm和12.286±0.808μm；Olive尾距分别为3.247±0.471μm、4.844±0.807μm、8.965±0.800μm和1.759±0.144μm。1,3-DCP各刺激组和对照组尾部DNA含量分别为23.80±2.48%、34.33±3.18%、38.03±3.63%和4.29±0.66%；尾长分别为58.67±6.38μm、79.67±5.86μm、84.86±6.07μm和12.29±0.81μm；Olive尾距分别为7.80±1.13μm、18.C_(50)±1.22μm、21.05±2.74μm和1.76±0.14μm。以上各实验组与对照组之间进行比较，均有显著性差异（p＜0.05）。3-MCPD和1,3-DCP对细胞DNA均有损伤作用。RIA结果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C细胞4h或24h，随着浓度的增加或时间的延长，具有抑制孕酮合成能力。3-MCPD刺激细胞4h，各刺激组与对照组相比，孕酮合成量没有显著性差异（p＞0.05）；3-MCPD继续作用细胞到24h，各刺激组和对照组的孕酮合成量分别为126.83±6.53ng、111.56±3.04ng、54.28±4.67ng和140.24±6.89ng。各刺激组与对照组相比有显著性差异（p＜0.05）。1,3-DCP刺激细胞4h，刺激组和对照组孕酮合成量分别为11.37±0.42ng、11.43±0.37ng、10.98±0.37ng和12.90±0.58ng，各刺激组与对照组相比均有显著性差异（p＜0.05）；1,3-DCP继续作用细胞到24h，各刺激组和对照组孕酮合成量分别为131.41±2.37ng、115.32±1.87ng、23.85±3.63ng和138.92±3.59ng。ICC_(50)和IC_(75)组分别与对照组进行比较，均有显著性差异（p＜0.05）。QRT-PCR结果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C细胞4h或24h，随着浓度的增加或时间的延长，具有抑制StAR、P4C_(50)scc和3β-HSD mRNA表达的能力。3-MCPD刺激细胞4h，StAR和P4C_(50)scc mRNA表达量在各组间无显著性差异（p＞0.05）；3β-HSD mRNA表达量在IC_(75)组比对照组下降46.8±6.90%，有显著性差异（p＜0.05），IC_(25)和ICC_(50)组分别与对照组相比，无显著性差异（p＞0.05）。3-MCPD刺激细胞24h，StAR mRNA表达量在ICC_(50)和IC_(75)组分别比对照组下降25.1±3.0%和51.7±3.0%；P4C_(50)scc mRNA表达量在IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)组分别比对照组下降32.6±2.3%、32.5±2.7%和31.9±1.9%；3β-HSD mRNA表达量在IC_(75)组比对照组下降21.8±4.4%。上述比较有统计学意义（p＜0.05）。1,3-DCP刺激细胞4h，StAR mRNA表达量组间无显著性差异（p＞0.05）；P4C_(50)scc mRNA表达量在IC_(75)组比对照组降低20.8±3.5%；3β-HSD mRNA表达量在IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)组分别比对照组降低39.5±5.5%、67.1±3.6%和70.4±1.7%。上述比较有显著性差异（p＜0.05）。1,3-DCP刺激细胞24h，StAR mRNA表达量在IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)组分别比对照组下降44.6±2.9%、45.6±2.3%和C_(50).3±4.6%；P4C_(50)scc mRNA表达量在ICC_(50)和IC_(75)组分别比对照组降低24.3±3.8%和45.5±4.4%；3β-HSD mRNA表达量在ICC_(50)和IC_(75)组分别比对照组降低27.6±2.6%和28.0±5.1%。上述比较有统计学意义（p＜0.05）。Western blotting检测结果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C细胞4h或24h，随着浓度的增加或时间的延长，，具有抑制StAR和3β-HSD蛋白表达的能力。3-MCPD刺激细胞4h，3β-HSD蛋白表达量在IC_(75)组比对照组下降60.5±5.1%，有统计学意义（p＜0.05）。3-MCPD刺激细胞24h， StAR蛋白表达量在IC_(75)组比对照组下降44.0±4.1%；3β-HSD蛋白表达量在ICC_(50)和IC_(75)组分别比对照组下降38.2±6.3%和63.0±7.1%。上述比较有统计学意义（p＜0.05）。1,3-DCP刺激细胞4h，StAR和3β-HSD蛋白表达量在IC_(75)组与对照组相比分别下降25.8±5.8%和C_(50).2±12.0%，有统计学意义（p＜0.05）。1,3-DCP刺激细胞24h，StAR蛋白表达量在IC_(75)组比对照组下降28.6±2.9%；3β-HSD蛋白表达量在IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)组分别比对照组下降42.0±2.5%、34.6±5.2%和43.3±5.1%。上述比较有统计学意义（p＜0.05）。FCM检测结果，3-MCPD刺激R2C细胞4h或24h，各刺激组MMP比对照组分别下降35.0±4.5%、35.5±3.9%、33.1±5.5%或23.7±5.9%、49.0±7.8%、53.9±9.4%，所述比较有统计学意义（p＜0.05）。1,3-DCP刺激R2C细胞4h，ICC_(50)和IC_(75)组比对照组分别下降24.3%和30.7%；继续刺激细胞到24h，IC_(75)组比对照组下降53.7%。所述比较有显著性差异（p＜0.05）。CL结果，3-MCPD刺激4h或12h各刺激组ROS水平比对照组分别升高60.9±17.1%、58.7±28.8%、93.5±20.1%或C_(50).5±23.9%、62.9±15.2%、71.4±20.3%，所述比较有显著性差异（p＜0.05）；同样条件，3-MCPD刺激细胞1h或24h，所得实验结果与对照组相比无显著性差异（p＞0.05）。1,3-DCP刺激细胞4h或12h，各刺激组ROS比对照组分别升高110.9±19.1%、138.7±20.8%、113.5±25.1%或C_(50).5±13.98%、92.9±17.2%、111.4±24.3%，除外IC_(25)12h组，其他所述比较有显著性差异（p＜0.05）；同样条件，1,3-DCP刺激细胞1h或24h，所得实验结果与对照组相比亦无显著性差异（p＞0.05）。cAMP检测结果，3-MCPD刺激R2C细胞4h，ICC_(50)和IC_(75)组cAMP水平比对照组分别降低30.0±7.2%和33.6±12.2%；1,3-DCP刺激R2C细胞4h，IC_(75)组cAMP水平比对照组降低34.4±11.9%。上述比较有显著性差异（p＜0.05）。体外受精实验结果，3-MCPD刺激小鼠卵母细胞，各刺激组和对照组碎裂率分别为10.14±3.82%、37.96±8.63%、46.15±6.94%和0%，各刺激组与对照组相比均有显著性差异（p＜0.05）。各刺激组和对照组受精率分别为77.00±12.79%、17.86±10.C_(50)%、13.24±6.38%和90.52±15.41%，ICC_(50)和IC_(75)组与对照组相比有显著性差异（p＜0.05）。早期胚胎发育结果，3-MCPD刺激小鼠受精卵，各刺激组和对照组2-细胞形成率分别为72.96±12.27%、60.76±12.68%、61.27±14.68和90.01±8.52%；4-细胞形成率分别为6.73±3.95%、5.63±3.74%、0.10±0.10%和24.41±8.33%；8-细胞形成率分别为0%、0%、0%和7.04±3.10%。各刺激组与对照组相比均有显著性差异（p＜0.05）。结论： 3-MCPD和1,3-DCP均有抑制R2C细胞生长作用，随着刺激浓度从IC_(25)到IC_(75)，细胞形态改变、细胞膜损伤和DNA损伤更明显；3-MCPD和1,3-DCP均能抑制孕酮合成。3-MCPD和1,3-DCP引起R2C细胞形态和功能改变的分子机制可能涉及StAR、P4C_(50)scc和3β-HSD基因表达下调，细胞MMP下降，细胞ROS上升和cAMP下降。3-MCPD抑制小鼠卵母细胞体外受精和早期胚胎发育。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114

【参考文献】