环介导等温扩增法快速检测食物中的单增李斯特菌

发布时间：2018-03-15 00:16

  本文选题：单增李斯特菌　切入点：环介导等温扩增　出处：《华南理工大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：单增李斯特菌为革兰氏阳性杆菌，是重要食源性人兽共患病病原微生物，该菌可引起人和多种动物的李斯特菌病。世界卫生组织已将其列为20世纪90年代四大食源性致病微生物之一。近年来世界范围内李斯特菌的发生有不断上升趋势，在食品中的污染广泛存在。目前，检测食品中单增李斯特菌传统方法的操作繁琐，，检测周期长，通常需要4~7天，不能满足食品中单增李斯特菌快速检测的需要。因此需要建立一种快速、方便的单增李斯特菌的检测方法。 2000年，Notomi T.等人研究开发出一种新的核酸扩增技术——环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）。该技术具有高特异性、高灵敏度、简便快速和成本低的特点，已在病毒、细菌以及转基因食品的检测中得到应用。 本研究以单增李斯特菌的hlyA基因作为靶基因，设计特异性引物，利用实时浊度监测仪65℃保温反应60min。特异性实验结果表明：LAMP法的特异性良好，能区分单增李斯特菌和其它食品中常见的细菌。灵敏度实验结果表明：检测该菌基因组DNA的灵敏度达92fg/反应管，检测该菌纯培养物的灵敏度达13CFU/反应管，检测人工污染样品的灵敏度达13CFU/反应管，均比PCR法高出10倍；结合3h的前增菌，LAMP法能检测出样品中极低浓度的单增李斯特菌。检测实际肉类样品的实验表明：与GB4789.30－2010培养方法比较，LAMP方法的符合率为96.67%，结合前增菌的LAMP方法的符合率为100%。 Calcein－Mn~(2+)作为一种新型指示剂，可以直接加到反应液中，对LAMP扩增反应的影响较少，最后显色得出实验结果与浊度仪指示结果一致。Calcein－Mn2+新型指示剂的开发和应用，简化了实验操作流程，降低了实验污染的概率。 本次研究所建立的LAMP方法能够直接对食品样品中的单增李斯特菌进行检测，大约1h即可完成，与传统培养方法相比，大大缩短了检测周期，为食品安全争取了更为广泛的时间范围。
[Abstract]:Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes) is a Gram-positive bacillus and an important foodborne zoonotic microorganism. In 1990s, the World Health Organization has listed it as one of the four major foodborne pathogenic microorganisms. In recent years, the occurrence of Listeria sp. Has been increasing worldwide. Contamination is widespread in food. At present, the traditional method of detecting Listeria monocytogenes in food is cumbersome, and the detection period is long. It usually takes 4 to 7 days. It can not meet the need of rapid detection of Listeria monocytogenes in food, so it is necessary to establish a rapid and convenient method for the detection of Listeria monocytogenes. In 2000, Notomi T.et al developed a new nucleic acid amplification technique, Loop-mediated isothermal amplification, which is characterized by high specificity, high sensitivity, simplicity and low cost. The detection of bacteria and genetically modified foods has been applied. In this study, the hlyA gene of Listeria monocytogenes was used as the target gene, a specific primer was designed, and the real-time turbidity monitor was used to keep the temperature at 65 鈩

本文编号：1613581