外侧杏仁核紧张性抑制电流在青春期的发育变化及机制

发布时间：2018-03-15 10:05

  本文选题：紧张性抑制电流　切入点：α3亚基　出处：《南方医科大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：青春期是人类生理和心理发育中的一个过渡时期,介于少年期和成人期之间的一段时间。青春期多发生在十几岁的年龄,在此时间内大脑发生很大的变化,暗示了很多行为学的变化。事实上,人在六岁时其脑体积就已经达到成人的百分之九十。所以在青春期脑体积的变化不是很明显,而最大的变化是控制认知和情感的皮层。 在青春期,青少年表现出很多与成人不同的行为,例如：冒险、易怒、暴力倾向等。而这些都与大脑处理情感的区域-杏仁核有着密不可分的关系。以前,很少有研究关注杏仁核,现在逐渐变成一个热门研究领域。早在19世纪杏仁核首次被确定为一个独立脑区。它的名字来源于希腊语,意思是颞叶内测的杏仁核形状的结构。 研究证实杏仁核内的局部抑制性回路对条件性恐惧和恐惧消退有重要作用。全脑或者局部提高γ-氨基丁酸能传递可以有抗焦虑的效果,而且可以阻止恐惧反应的获得和表达。相反,通过药理学方法降低γ-氨基丁酸能传递可以产生焦虑样症状并且租金恐惧反应的学习和恢复。 γ-氨基丁酸可以通过两种方式发挥作用。第一种：从突触前膜末端释放出来,与位于突触间隙内的突触后膜受体结合。这种经典的结合方式是在采用点对点的方式,所以叫做时相抑制。还有一种形式,γ-氨基丁酸从突触间隙一出道突触外,与突触周边的受体结合。这种受体与γ-氨基丁酸具有很高的亲和力,而且不易失敏。这种方式被叫做紧张性抑制。 紧张性抑制可以持续性地引起电流跨膜流动,从而调节神经元的兴奋性。这种方式引起的跨膜阴离子数量大约是时相性抑制的3.5倍。除此之外,紧张性γ-氨基丁酸A型受体在神经前体细胞也有大量表达,暗示其对神经元发育有重要作用。在小脑颗粒层细胞,紧张性γ-氨基丁酸电流随着发育的神经元成熟逐渐增多,抑制性突触后电流幅度逐渐减小和频率加快。在成年后,紧张性抑制电流的幅度和时相性抑制电流峰值相当。在另一项研究中,海马DG区的颗粒细胞在出生后2周内表达,但是到成年后显著减少。在VBN,神经元在发育中也有紧张性电流的明显变化。 最近相关文献报道,杏仁核中也有紧张性抑制电流的表达。研究者发现,外侧杏仁核的主细胞存在这种电流,但是在发育中是否有变化还没有报道。再者考虑到以及紧张性抑制电流在发育中的重要作用,我们决定研究外侧杏仁核主细胞上的紧张性抑制电流的发育变化。 首先,我们分别记录在20uM GABA和BIC药物作用下的钳制电流,然后两者相减的差值等于紧张性抑制电流的幅度。实验结果显示在出生后15-20天,30-40天和55-60天,紧张性抑制电流的表达有所变化。在30到40天时,外侧杏仁核的紧张性抑制电流表达相对较弱(10.56±1.11pA,n=14),明显低于在出生后15-20天(42.05±6.75pA,n=20)和55-60天(29.79±4.59pA,n=10)的水平。15-20天和55-60天的表达没有显著区别。 为了确定这种变化在外侧杏仁核主细胞的特异性,我们也对不同发育期的海马CA1区和mPFC区进行了研究。我们使用的GABA浓度以及检测时间点(出生后15-20,30-40,55-60天)与杏仁核区相同。在出生后15-20天的小鼠海马CA1锥体神经元上,记录到43.99±11.83pA(n=7)大小的紧张性抑制电流。在30-40天大小的小鼠海马则记录到38.83±11.75pA(n=7)的电流,与15-20天的电流大小相近。在55-60天的海马此电流幅度约为48.13±15.51pA(n=7),与前面15-20天和30-40天的电流幅度没有显著差异(P0.05; ANOVA).此结果证明,海马CA1区锥体神经元的紧张性抑制电流幅度在不同发育阶段没有变化。在PFC区,出生后15-20天,30-40天和55-60天的紧张性抑制电流非别为31.70±4.99pA,25.75±6.86pA和24.98±3.70pA。ANOVA分析显示没有显著差异。这些结果提示在青春期,紧张性抑制电流对杏仁核的调控相对于海马和前额叶明显减弱,因此,处于青春期的青少年的杏仁核活动活跃而使他们更难于控制情感。 接下来,我们想了解是哪种GABAA受体的亚基介导了紧张性抑制电流。我们使用神经药理学的方法(GABAA受体不同亚基的激动剂和阻断剂)研究出生后15-20天小鼠外侧杏仁核主细胞的紧张性抑制电流。我们加入L-655708,一种α5-GABAA受体的特异性反向激动剂,然后检测其对紧张性抑制电流的作用。结果显示,L-655708不能显著抑制紧张性电流,而加入BIC后,可以完全阻断(L655708-GABA:1.29±1.82pA vs0pA, n=6, P0.05)。这证明紧张性抑制电流不是由α5-GABAA受体介导。在另一组实验中,我们使用δ-GABAA受体激动剂去研究紧张性电流。结果显示,THIP只能产生4.34±0.90pA的电流,提示δ亚基不是紧张性GABAA受体的主要组成成分。这些结果提示杏仁核中介导紧张性抑制电流的受体亚基与其他脑区不相同。 在更进一步的研究中,我们使用α3GABAA受体激动剂。在不同年龄段小鼠的外侧杏仁核主细胞上,此类药物可以诱导出紧张性抑制电流,分别为：出生后15-20天：36.07±6.79pA；30-40天：10.42±1.94pA；55-60天：26.59±4.59pA。其中,30-40天的电流幅度明显低于15-20天组和55-60天组,15-20天组和55-60天组之间没有明显差异(n=6,P0.01, ANOVA)。此外,此类激动剂对自发放的IPSC幅度和频率都没有明显作用,从而证明了α3GABAA受体不会影响突触传递。 为了确定α3GABAA受体对总的紧张性抑制电流的贡献,我们比较了出生后15-20天小鼠外侧杏仁核主细胞TP003和20μM的GABA引起的紧张性电流的幅度。结果显示,20μM GABA引起的紧张性电流的幅度高于TP003引起的幅度,但无显著性差异[GABA:42.05±6.75pA (n=20) vs TP003:36.07±6.79pA(n=6),P0.05；独立样本t检验]。 接下来我们想研究外侧杏仁核主细胞上的此类紧张性抑制电流是否足够强,从而引起主细胞兴奋性的改变。为了避免外侧杏仁核中谷氨酸能突触的活动影响,我们用2mM犬尿烯酸阻断谷氨酸能受体,在神经元胞体直接注射电流诱发动作电位产生。结果显示,在青春期(P30-40)的小鼠外侧杏仁核主细胞,TP003不能减少动作电位的发放(动作电位个数：30-40天对照组5.6±0.19个；TP003组5.72±0.26个,BIC组5.48±0.25个；n=5,P0.05;ANOVA)。在15-20天和55-60天的小鼠,加入TP003可以明显减少动作电位的数(动作电位数量：15-20天对照组6.56±0.17个,TP003组3.04±0.12个,BIC组6.44±0.17个：55-60天对照组6.32±0.17个,TP003组4.08±0.16个,BIC组6.52±0.14个；n=5,P0.01;ANOVA)。而在加入BIC后,减少的动作电位数量又恢复。这些结果证明在不同发育阶段,a3GABAA受体在外侧杏仁核的表达不同,从而在调节杏仁核的活动中发挥不同作用。 接下来我们探索α3亚基调控主细胞的机制。我们检测了外侧杏仁核主细胞的膜电位是否会受到α3亚基的影响。我们通过膜片钳贴附式记录的方法,给细胞膜一个命令阶跃电压,激活电压依赖性钾电流,测出其反转电位,这个值与主细胞的静息电位相等。结果显示,TP003没有显著的改变外侧杏仁核主细胞的静息电位(静息电位：对照组-70.55±2.01mV,TP003组-70.10±2.88mV,n=8, P0.05)。 综上所述,我们的研究结果显示α3型GABAA受体介导的紧张性抑制电流在小鼠青春期的外侧杏仁核主细胞表达发生变化,而且这种受体可以减少外侧杏仁核主细胞的兴奋性活动。这些机制可能解释青春期的动物为什么更容易受情感事件的影响。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R179

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