甲状腺激素对神经干细胞向神经元分化的调整作用及机制研究

发布时间：2018-03-29 14:28

  本文选题：神经干细胞　切入点：神经发生　出处：《第三军医大学》2012年博士论文

【摘要】：目的：甲状腺是多种职业有害因素损伤的主要靶器官之一。研究表明，妊娠期多种类型职业有害因素暴露均可导致机体甲状腺激素(TH)缺乏，从而损伤子代神经发育。TH是调控脑发育的必要激素之一，发育期间TH缺乏可导致突出生长、突触形成、神经元迁移、髓鞘形成等多种发育障碍。尽管既往针对TH对脑发育的影响研究较多，但大都集中在对TH在妊娠晚期及出生后功能的探讨，而TH在胚胎早期发育过程中的作用，尤其是对胚胎神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的作用及机制未见文献报道。文献报道表明，TH在妊娠早期既已出现在胚胎脑内，且甲状腺激素受体(TR)在胚胎脑内出现的时间比TH还早，提示TH-TR极有可能参与调控了早期脑的发育过程。基于以上认识，本研究拟通过建立妊娠期甲减动物模型，探讨妊娠期TH缺乏对胚胎脑神经发生的影响及子代鼠成年后学习记忆功能的变化。并通过建立体外培养NSCs模型，探讨TH对NSCs向神经元分化的影响，并以TR及调控NSCs增殖分化的主要信号通路MAPK(Erk1/2)、mTOR/Akt及JAK/STAT3为切入点探讨其相应的分子机制。 方法：①取妊娠0天Balb/c孕鼠，以含PTU(500mg/L)的饮用水喂养至妊娠结束，并在妊娠第0d和第7d腹腔注射PTU(10mg/kg)，建立妊娠期甲状腺功能减退的动物模型。②于E13.5天时，，采用Real time PCR检测端脑Tuj1mRNA表达，于E16.5天时，采用免疫组化检测胎鼠端脑新生神经元数目，探讨PTU处理对胚胎鼠神经发生的影响。③采用放免法检测PTU处理第13d孕鼠及1M龄子代鼠血清TH水平；采用Morris水迷宫实验检测子代鼠2M龄时学习记忆功能。④体外分离培养E13.5端脑NSCs，并采用生理浓度T3(0.3nM)处理NSCs，采用Neurosphere assay、CCK-8、TUNEL、Real time PCR及免疫荧光细胞化学检测T3对NSCs维持、增殖、凋亡及分化的影响，以及分化神经元突出生长情况，探讨T3对NSCs神经元分化的作用。⑤分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测在体及离体NSCs上TR mRNA及蛋白表达情况；并通过TRα1特异性siRNA干扰TRα1表达后，进一步观察T3对NSCs向神经元分化的影响，以及对NSCs维持、增殖及凋亡的影响，探讨TRα1在T3调控NSCs向神经元分化中的作用。⑥采用Western blot检测T3对Erk1/2、Akt及STAT3蛋白表达及磷酸化的影响，采用EMSA检测T3对STAT3-DNA结合活性的影响，探讨T3对STAT3信号通路活性的影响。⑦采用TRα1特异性siRNA干扰其表达后观察T3对STAT3信号通路活性的影响，探讨TRα1在T3调控STAT3信号通路活性中的作用。⑧采用STAT3特异性抑制剂Stattic(5μＭ)处理NSCs后，观察NSCs向神经元分化情况，以及细胞维持及增殖情况，从而探讨STAT3信号通路在调控NSCs向神经元分化中的作用。⑨采用STAT3质粒转染在NSCs上过表达STAT3，上调STAT3信号通路活性，进一步观察T3对NSCs向神经元分化、细胞维持及增殖的影响，探讨STAT3信号通路在T3调控NSCs向神经元分化中的作用。⑩采用SPSS13.0进行数据统计分析。 结果：①妊娠期PTU处理13d后，孕鼠血清FT3及FT4水平明显低于对照组；而子代鼠出生后1M龄时，血清FT3及FT4浓度无明显改变；PTU处理16.5d后，胎鼠端脑VZ/SVZ区Tuj1阳性细胞明显少于对照组，且端脑Tuj1mRNA表达也显著降低；子代鼠2M龄时，经Morris水迷宫检测，PTU组寻找平台的潜伏期明显长于对照组，而在目的象限搜索时间及穿越虚拟平台的次数明显少于对照组。②生理浓度T3(0.3μＭ)处理NSCs6d后，NSCs向神经元分化数目增多，Tuj1mRNA表达增高，并且分化神经元突出总长度、一级分叉点数目及初级突出数目均较对照组增加；而向星形胶质细胞分化数目与GFAP mRNA表达减少；处理9d后，可见少突胶质细胞分化数及CNPase mRNA表达明显增高；同时第一代及第二代神经球形成数目、Sox2mRNA表达与细胞增殖在T3处理后明显降低，但TUNEL阳性细胞数目无明显改变。③TRα1mRNA及蛋白在E13.5离体培养及端脑NSCs上均存在表达，但TRβ不表达；通过TRα1特异性siRNA干扰TRα1表达后，再采用T3处理，发现T3对NSCs向神经元分化及分化神经元突出生长的促进作用，对星形胶质细胞分化的抑制作用，对细胞增殖和维持的抑制作用均有所逆转。④生理浓度T3处理1d、2d及3d后，Erk1/2与Akt蛋白表达及磷酸化均无明显改变，而STAT3蛋白磷酸化显著降低，进一步研究发现STAT3-DNA结合活性在T3处理后也明显降低；⑤采用TRα1特异性siRNA干扰其表达后，再采用T3处理细胞，发现T3对STAT3磷酸化以及对STAT3-DNA结合活性的抑制作用均显著减弱。⑥采用STAT3特异性抑制剂Stattic(5μM)处理NSCs后，能够诱导其向神经元分化，抑制其向星形胶质细胞分化，且抑制NSCs维持与增殖。⑦通过转染STAT3质粒在NSCs上过表达STAT3，上调STAT3信号通路活性后，再采用T3处理NSCs，发现T3对神经元分化的促进作用，以及对NSCs维持和增殖的抑制作用均有所逆转。 结论：①妊娠期TH缺乏损伤成年海马神经发生，进一步导致学习记忆功能障碍。②生理浓度T3促进NSCs向神经元分化及分化神经元突出生长，抑制其向星形胶质细胞分化，同时抑制NSCs维持与增殖。③TRα1在E13.5离体培养及在体NSCs上均存在表达，且参与介导了T3对NSCs向神经元分化的促进作用。④生理浓度T3处理抑制STAT3信号通路活性，且T3对STAT3信号通路的抑制作用需要TRα1介导。⑤抑制STAT3信号通路活性可诱导NSCs向神经元分化。⑥上调STAT3信号通路活性可拮抗T3对NSCs的调控作用，表明T3通过抑制STAT3信号通路介导了对NSCs向神经元分化的促进作用。综上所述，可得出结论甲状腺激素通过TRα1下调STAT3信号通路活性，促进NSCs向神经元分化，从而促进端脑神经发生；妊娠期TH缺乏将导致NSCs向神经元分化减少，抑制胚胎神经发生，进一步损伤子代成年后学习记忆功能。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R135

【引证文献】

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1 李丹丹;庞妩燕;薛磊;;甲状腺激素缺乏对脑发育期胶质细胞影响的研究[J];中国当代医药;2013年21期

本文编号：1681544