累托石纳米颗粒有机改性前后细胞毒性的研究及其相关应用的探讨

发布时间：2018-04-02 08:32

本文选题：累托石　切入点：纳米颗粒　出处：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：累托石(Rectorite, REC)是一种规则层状硅酸盐粘土矿物,已被研究用于食品和医疗等领域,但其毒性方面的探讨仍旧缺乏。紫杉醇(Paclitaxel, PTX)作为一种有效的抗肿瘤药物,在实际的临床应用中仍然存在许多不足之处。在此,我们主要讨论了REC有机改性前后细胞毒性作用大小的改变及相关毒性作用的机制,以及REC对紫杉醇纳米纤维素膜药物传递系统抑癌活性的影响。本研究主要由以下两部分组成：第一部分钙基累托石纳米颗粒有机改性前后的细胞毒性的研究目的：在本研究中,我们通过分析REC有机改性前后理化性质的改变,及其对于人张氏肝细胞及人肝癌细胞HepG2的毒性作用及相关机制,为REC及有机累托石(Organic modified rectorite, OREC)在未来应用中的安全性提供实验依据。方法：用REC与十六烷基三甲基溴化铵阳离子交换制备OREC并测定REC及OREC的粒径大小和ζ电位；用热重曲线分析两者的热稳定性；用傅里叶变换红外光谱、透射电镜和小角X射线衍射评价REC及OREC的层间距大小及化学组成；用能量色散X射线光谱判断人张氏肝细胞中REC及OREC的摄入：浓度为0、1、2.5、5、7.5和10 μg/mL的REC或OREC分别处理人张氏肝细胞和HepG2细胞6、24及48 h后,采用MMT法检测其细胞毒性；浓度为0、1、2.5、5、7.5和10μg/mL的REC或OREC处理人张氏肝细胞24 h后,用流式细胞术分析细胞的凋亡和坏死；0、1、2.5、5、7.5和10μg/mL REC或OREC处理人张氏肝细胞6h或24 h后,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和pro-caspase-3的表达。5 μg/mL的REC或OREC处理HepG2细胞24后,扫描电镜下观察自噬小体并检测自噬相关蛋白的表达。结果：REC在有机改性后,层间距增加。REC及OREC处理人张氏肝细胞24 h后,纳米颗粒被摄入细胞内。1、2.5、5、7.5及10μg/mL的REC或OREC处理人张氏肝细胞和HepG2细胞6、24和48 h后,均能观察到细胞活性下降(P0.05 or P0.01),且OREC所致的细胞毒性较REC大,两种细胞间毒性作用没有差异。7.5和10 μg/mL的REC或OREC处理24 h后,人张氏肝细胞的凋亡坏死率均有提高(P0.05 orP0.01)。5、7.5、10μg/mL的REC或OREC处理人张氏肝细胞24 h后,Bax、Bcl-2及pro-Caspase-3的表达均有所下降,但Bax/Bcl-2比值没有变化,提示并非通过Bax相关线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。5μg/mL的REC或OREC处理HepG2细胞24 h后,均能在细胞内观察到自噬小体,且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大,提示自噬的发生。结论：研究结果表明,有机改性后,REC的理化特性在各方面均有较大的提升,但其细胞毒性也有明显的增加。R EC及OREC通过细胞凋亡以及细胞自噬共同诱导细胞的死亡。在实现OREC在食品和医疗等领域的应用时应注意其生物安全性。第二部分累托石对紫杉醇纳米纤维素膜体外抑癌活性影响的研究目的：我们以醋酸纤维素(Cellulose acetate, CA)作为辅料,采用静电纺丝法制作紫杉醇醋酸纳米纤维素膜(CA/PTX0.06及CA/PTX0.12)及加入累托石(Rectorite, REC)的紫杉醇醋酸纳米纤维素膜(CA/PTX0.06/REC及CA/PTX0.12/REC),并研究REC对纳米纤维理化性质、体外PTX药物释放行为以及对人胃细胞毒性的影响。方法：纳米纤维素膜形貌,选用场发射扫描电子显微镜观察；布鲁诺尔-埃米特-特勒比表面积,选用氮吸附法测定；复合纳米纤维素膜的组成成分,由能量色散X射线测定；膜中PTX、CA、REC的相互作用,由傅里叶变换红外光谱和广角X射线衍射研究；热稳定性由差示扫描量热法以及热重分析确定；复合纳米纤维素膜中PTX在pH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水的释放行为,用高效液相色谱测定；人胃癌细胞SGC7901,以及人胃上皮细胞GES-1在纳米纤维素膜上生长24 h后,细胞毒性由LIVE/DEAD细胞活性/细胞毒性试剂盒测定,细胞超微结构通过扫描电镜观察。结果：REC和PTX均被成功纺入复合纳米纤维素膜。并且CA的热稳定性未受到影响。所有复合纳米纤维素膜的纤维表面光滑,各样本纤维间的形貌没有明显差别,在加入REC后比表面积有所增加。膜上种植细胞前后,所有的膜样品均表现出典型的3D电纺纳米纤维形貌。CA/PTX和CA/PTX/REC膜中PTX的释放行为保持相对稳定缓慢,并且REC提高了药物的释放率。CA/PTX和CA/PTX/REC对SGC7901和GES-1细胞均有毒性,两种细胞系的毒性作用没有显著区别,且CA/PTX/REC毒性均较CA/PTX大。所有的膜都能为GES-1和SGC7901细胞的附着和延伸提供良好的支架。结论：CA及CA/REC均具有较高的细胞亲和力,CA/PTX及CA/PTX/REC释放PTX稳定,且表现出一定的细胞致死能力。REC通过提高PTX的累计释放量对PTX的抑癌活性起到协同增效的作用,有利于长期有效的治疗肿瘤。CA/PTX、CA/REC及CA/PTX/REC复合纳米纤维素膜在控制释药系统和组织工程的应用方面具有强大的潜力。
[Abstract]:In this study , we mainly discussed the changes of the physical and chemical properties before and after the organic modification of REC and the mechanism of the effect of REC on the anti - cancer activity of the drug delivery system of Paclitaxel nano - cellulose membrane .
the thermal stability of the two is analyzed by using a thermal stress curve ;
Fourier transform infrared spectroscopy , transmission electron microscope ( TEM ) and small angle X - ray diffraction ( X - ray diffraction ) were used to evaluate the interlayer spacing and chemical composition of REC and oreC ;
It was determined by using the energy dispersive X - ray spectrum that the uptake of REC and oreC in human liver cells was 0 , 1 , 2.5 , 5 , 7.5 and 10 渭g / mL , respectively . After 6 , 24 and 48 h of human liver cells and HepG2 cells , the cytotoxicity of the cells was detected by MMT .
The apoptosis and necrosis of the cells were analyzed by flow cytometry after 24 h of human being treated with REC or oreC at concentrations 0 , 1 , 2.5 , 5 , 7.5 and 10 渭g / mL .
The results showed that the cell activity decreased ( P0.05 or P0.01 ) . The results showed that the cell activity decreased ( P0.05 or P0.01 ) . The results showed that the cell activity decreased ( P0.05 or P0.01 ) . The results showed that the cell activity decreased ( P0.05 or P0.01 ) .
Brunel - Eminite - Butler specific surface area , determined by nitrogen adsorption method ;
the component of the composite nano - cellulose film is determined by the energy dispersive X - ray ;
The interaction of PTX , CA and REC in the membrane was studied by FTIR and wide - angle X - ray diffraction .
the thermal stability is determined by differential scanning calorimetry and thermal analysis ;
The release behavior of PTX in phosphate buffered saline with a pH of 7.4 in a composite nanofiber membrane was determined by high performance liquid chromatography ;
The effects of CA / PTX and CA / PTX / REC on the inhibition of PTX and CA / PTX and CA / PTX / REC showed no significant difference , and the surface area of CA / PTX and CA / PTX / REC was relatively stable , and the surface area of CA / PTX and CA / PTX / REC was relatively stable .

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114

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