Calpeptin拮抗丙烯酰胺中毒大鼠神经丝磷酸化相关激酶的机制

发布时间：2018-04-13 16:22

  本文选题：丙烯酰胺 + Calpeptin　； 参考：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的丙烯酰胺(acrylamide/acrylicamide,ACR)是一种水溶性的、乙烯基白色晶体,应用广泛。研究表明,ACR引起以共济失调、骨骼肌无力、震颤为主的周围神经退行性变。蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)、蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)、周期素依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependentkinase5,Cdk5)可磷酸化富含丝氨酸/苏氨酸的神经丝(neurofilament,NFs)蛋白,使NFs结构功能发生改变,影响细胞骨架形成。钙蛋白水解酶(calpain)依赖Ca~(2+)激活,可改变PKA、PKC、Cdk5等含量。我们推测,ACR可能通过Ca~(2+)活化calpain,以激活PKA、PKC、Cdk5,改变NFs磷酸化状态,最终致ACR神经病。本实验建立大鼠ACR亚慢性中毒模型及钙蛋白酶抑制剂calpeptin(CP)干预模型,观察神经行为学及病理形态,检测Ca~(2+)浓度、PKA、PKC、Cdk5含量,探讨CP拮抗丙烯酰胺中毒大鼠神经丝磷酸化相关激酶的机制。方法1.模型建立:成年雌性60只Wistar大鼠随机分为四组,即空白对照组、CP对照组、ACR模型组、ACR+CP干预组。ACR模型组和ACR+CP干预组按30mg/kg·bw腹腔注射ACR染毒3次/周,空白对照组给予等体积生理盐水;CP对照组与ACR+CP干预组给予200ug/kg·bwCP,6次/周,连续四周。染毒终止,分离脊髓与坐骨神经备用。染毒期间每周进行体重称量、步态评分和后肢抓力的测定。2.钙离子:分离脊髓,钙离子荧光探针(Fura-2/AM)负载法测定钙离子浓度。3.蛋白含量:使用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot法对脊髓和坐骨神经组织中PKA、PKC、Cdk5含量分析。4.NFs磷酸化:常规免疫组化法(SP法),观察脊髓与坐骨神经内NFs磷酸化水平。5.形态学:HE和甲苯胺蓝染色观察脊髓与坐骨神经病理形态;透射电镜观察坐骨神经组织内有髓神经纤维以及g-Ratio变化。结果1.体重自染毒第二周起,与空白对照组相比,CP对照组无明显差异(P0.05),ACR模型组同期体重明显低于空白对照组(P0.05);与ACR模型组相比,ACR+CP干预组同期体重明显高于ACR模型组(P0.05)。2.神经行为学(1)步态评分:自染毒第二周起,与空白对照组比,CP对照组无明显差异(P0.05),ACR模型组得分同期明显升高(P0.05);与ACR模型组比,ACR+CP干预组同期得分明显降低(P0.05)。(2)后肢抓力:自染毒第二周起,与空白对照组比,CP对照组无明显差异(P0.05),ACR模型组同期抓力明显降低(P0.05);与ACR模型组比,ACR+CP干预组同期抓力明显升高(P0.05)。3.脊髓Ca~(2+)含量与空白对照组比,CP对照组的Ca~(2+)浓度无显著变化(P0.05),ACR模型组的Ca~(2+)浓度显著升高(P0.05);与ACR组比,ACR+CP干预组的Ca~(2+)浓度显著降低(p0.05)。4.NFs磷酸化相关激酶与空白对照组比,ACR模型组脊髓组织中PKA含量略有降低(P0.05),PKC含量显著升高(P0.05),坐骨神经组织中PKA、PKC和Cdk5含量均显著升高(P0.05);与ACR模型组比,ACR+CP干预组脊髓组织中PKA明显升高(P0.05),PKC含量显著下降(P0.05),坐骨神经组织中PKA、PKC和Cdk5含量均显著下降(P0.05)。5.脊髓及坐骨神经NFs磷酸化ACR模型组大鼠磷酸化的NFs较空白对照组染色深,而ACR+CP干预组大鼠染色较ACR模型组染色浅;ACR模型组非磷酸化的NFs较空白对照组染色浅;ACR+CP干预组较ACR模型组染色深。6.组织形态学(1)脊髓:与空白对照组比,ACR模型组运动神经元减少,核固缩、核膜核仁溶解或消失,尼氏体分布降低;与ACR模型组比,ACR+CP干预组运动神经元较正常、数量略有增加,尼氏体增加。(2)坐骨神经:与空白对照组比,ACR模型组的坐骨神经截面破损,细胞稀松,髓鞘排列松散,髓鞘板层断裂和/或向内挤压轴浆,g-Ratio显著下降(P0.05);与ACR模型组相比,ACR+CP干预组髓鞘损伤得到缓解,g-Ratio显著上升(P0.05)。结论1.CP能够拮抗ACR中毒引起的大鼠异常神经行为功能改变以及脊髓和坐骨神经病理形态学改变。2.CP能够拮抗ACR引起的钙离子、神经丝磷酸化激酶以及NFs磷酸化水平的改变。3.CP可能通过抑制Ca~(2+)-Calpain-激酶-NFs通路中Ca~(2+)及NF磷酸化相关激酶拮抗ACR中毒。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114

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本文编号：1745272