十溴联苯醚对原代培养胎鼠海马神经元CHOP和Caspase-12蛋白表达影响的研究

发布时间：2018-05-01 06:13

  本文选题：胎鼠 + 海马神经元　； 参考：《安徽医科大学》2013年硕士论文

【摘要】：背景 许多研究结果表明，神经细胞在体外发育成熟后，仍能保持或接近在体细胞的各项生理参数，且原代培养的细胞要比多次传代的细胞更接近体内神经细胞的正常发育状态，并具有实验周期短、条件因素易控制、同批样本条件一致、对比性好等优点。故建立海马神经元的分离、培养方法，为进行海马神经元的体外研究提供技术支持。 方法 取GD18ICR小鼠，在体式显微镜下分离胎鼠海马，经消化后种植于有多聚赖氨酸包被的6孔板上，24h后换含有B27的DMEM/F12无血清培养基，分别于不同时间在倒置显微镜下相差观察细胞的生长状态；采用结构性微管相关蛋白-2（Microtubule associated protein-2，Map-2）免疫细胞化学方法鉴定海马神经元细胞。 结果 海马神经元培养2h后部分细胞开始贴壁，个别细胞长出1-2个细小的突起，24h后，大部分细胞长出3-4个突起，长度较长，有少数细胞聚合。3d后，神经元突起增多并延长，形成稀疏的网络，细胞具有典型神经元的形态特征。5d后，神经元胞体逐渐生长，突起逐渐延长，形成较密的网络。7d后观察神经元细胞生长良好，胞体清晰明亮，周围有光晕，胞核也清晰可见，突起变长变粗，并形成明显的神经网络，趋于成熟。经Map-2免疫荧光细胞化学方法鉴定神经元，结果可见分散的海马神经元，神经元占主体。 结论 本方法可以获取生长良好，纯度较高的海马神经元。表明培养神经元方法具有可行，结果稳定的优点，可作为神经元体外培养的良好模型，并为下步的研究提供依据。 背景 研究十溴联苯醚(decabromodiphenylether，BDE-209)对胎鼠海马神经元形态结构、细胞存活率、氧化应激情况以及CHOP和Caspase-12蛋白表达水平的影响，从而初步探讨内质网应激在BDE-209对海马神经元影响中的作用，为建立体外研究BDE-209的神经毒性机制提供依据。 方法 原代培养7d后的胎鼠海马神经元暴露于BDE-209，实验共分为6组，即对照组（含1‰DMSO的培养液）和实验A（6.25μg/ml BDE-209）、B（12.5μg/mlBDE-209）、C （25μg/ml BDE-209）、D （50μg/ml BDE-209）、E （100μg/mlBDE-209）组。每组设3个平行样。染毒24h后在倒置显微镜下用相差观察各组细胞形态； MTT比色分析法检测各组海马神经元的存活率；测定海马神经元超氧化物歧化酶（SOD）活力和一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）与谷胱甘肽（GSH）的含量，，并用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测神经元中CHOP、Caspase-12、Bax以及Bcl-2蛋白的表达情况。 结果 倒置显微镜利用相差观察不同剂量组海马神经元细胞形态，实验组可见神经元细胞胞体变小和变形，细胞膜完整但有发泡现象，随着染毒剂量的增加，发泡现象明显，神经突起变短，在实验D组（50μg/ml BDE-209）、E（100μg/mlBDE-209）组中可见细胞出现皱缩、变圆、脱落，突起缩短甚至消失。MTT比色法检测海马神经元的存活率，随着BDE-209浓度的增加，海马神经元细胞存活率明显下降（P0.05），实验各组与对照组相比差异有显著性意义（P0.05）。实验组与对照组相比，各染毒组SOD活力下降、NO含量增加、MDA含量增加，差异均有统计学意义（P0.01），各染毒组GSH含量随BDE-209剂量的增加而降低，其中B、C、D、E组与对照组相比，差异有统计学意义（P0.05）。Western blot结果显示：BDE-209暴露原代培养胎鼠海马神经元可致实验C（25μg/mlBDE-209）、D（50μg/ml BDE-209）、E（100μg/ml BDE-209）组与对照组相比CHOP表达增加，差异有统计学意义（P0.05）；实验B（12.5μg/ml BDE-209）、C（25μg/ml BDE-209）、D（50μg/ml BDE-209）、E（100μg/ml BDE-209）组与对照相比Caspase-12表达增加，差异有统计学意义（P0.05），实验A（6.25μg/ml BDE-209）组Caspase-12表达低于对照组，但差异无统计学意义（P0.05）；实验B（12.5μg/ml BDE-209）、C（25μg/ml BDE-209）、D（50μg/ml BDE-209）、E（100μg/ml BDE-209）与对照组相比，Bax/Bcl-2比值升高，差异有统计学意义（P0.05）。 结论 BDE-209可引起胎鼠海马神经元细胞形态的改变和存活率的下降，与BDE-209有一定剂量反应关系。BDE-209可以引起原代培养胎鼠海马神经元细胞的氧化损伤，并引起内质网应激相关蛋白CHOP，Caspase-12和凋亡相关蛋白Bax以及Bcl-2的表达。
[Abstract]:Background

The results showed that the neural cells were able to maintain or close to the physiological parameters of the cells in vitro after maturation in vitro , and the cells cultured in the primary culture were more closely related to the normal development of the cells in vivo than those of many passaged cells , and had the advantages of short experiment period , easy control of the condition factors , good agreement with the batch samples , good contrast , and the like .

method

GD18ICR mice were isolated from fetal rat hippocampus under a body microscope . After digestion , they were cultured on 6 - well plates coated with poly - lysine . After 24 h , the serum - free medium of DMEM / F12 was changed , and the growth state of the cells was observed by contrast microscope at different times .
The hippocampal neuronal cells were identified by using structural microtube - associated protein - 2 ( Map - 2 ) immunohistochemical method .

Results

After 2 hours of culture , the cells began to adhere to the wall , the individual cells grew out 1 - 2 small protrusions , after 24 h , most of the cells grew 3 - 4 projections , the length was longer , and the cells became thinner . After 5 days , the cells grew gradually and the cells became dense . After 7 days , the neurons were observed to grow well , the cells became mature , and the neurons were identified by the method of Map - 2 immunofluorescence cytochemistry .

Conclusion

The method can obtain the hippocampal neurons with good growth and high purity , and shows that the method has the advantages of being feasible and stable , and can be used as a good model for the in vitro culture of neurons , and provides a basis for the research of the next step .

Background

The effects of decabromodilution ( BDE - 209 ) on the morphological structure , cell survival rate , oxidative stress and CHOP and Caspase - 12 protein expression were investigated .

method

The rat hippocampal neurons were exposed to BDE - 209 after 7 days of primary culture . The experiment was divided into 6 groups : control group ( medium containing 1 鈥

本文编号：1828077