DNA-PKcs-Chk2信号通路调控细胞有丝分裂进程及H2AX磷酸化

发布时间：2018-05-05 18:13

  本文选题：γH2AX + Chk2　； 参考：《南华大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的： 观察细胞周期G2/M期γH2AX焦点的形成，探讨与有丝分裂进程相关的H2AX磷酸化的规律特征，分析γH2AX作为DNA DSB损伤和修复分子标志物的合理性；建立Chk2稳定过表达和沉默的细胞系，研究其对有丝分裂进程、电离辐射诱导的G2/M期阻滞、细胞凋亡和肿瘤治疗药物敏感性的影响，从而为寻找肿瘤放疗和化疗的新靶点提供思路和实验依据。 方法： 采用胸腺嘧啶双阻滞结合噻氨酯哒唑的后续处理，将HeLa细胞同步于有丝分裂的前中期，通过流式细胞仪检测细胞周期、western blotting和激光共聚焦免疫荧光法，观察γH2AX蛋白水平表达和γH2AX焦点的形成。利用PCR法将外源基因导入真核表达载体，利用Lipofectamin2000脂质体转染法，经G418或Hygromycin抗性筛选获得稳定过表达和沉默的HeLa细胞系，采用quantitativeReal-Time PCR和western blotting鉴定构建的Chk2稳定过表达和沉默的HeLa细胞系，利用胸腺嘧啶双阻滞释放法结合流式细胞仪分析细胞系细胞周期的变化；应用细胞生长曲线检测Chk2沉默对HeLa细胞生长速率的影响；AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞仪分析电离辐射诱导的细胞凋亡情况；westernblotting检测电离辐射处理下Chk2沉默细胞和对照细胞中p53和pig3的表达变化，MTT法检测细胞对肿瘤治疗药物紫杉醇敏感性的影响；Time lapse法实时观察DNA-PKcs沉默或活性抑制的HeLa细胞有丝分裂情况。 结果： 1、HeLa细胞进入G2/M期和有丝分裂过程中，γH2AX水平显著增加；在无DNA DSB发生的情况下，部分M期细胞中也存在大量的γH2AX焦点。随着细胞完成有丝分裂从M期退出再进入G1期，，γH2AX的表达水平逐渐降低。这种γH2AX表达变化特征几乎与G2/M期密切关联的PLK1和Cyclin B1的表达规律相类似。 2、在4Gy大剂量照射下，HeLa细胞于照后8h和12h出现明显的G2/M期阻滞，γH2AX焦点数在照后1h达高峰，随后降低，照后8h又上升出现了第二个峰值。与之不同的是，在1Gy低剂量照射下，细胞的G2/M期阻滞微弱，γH2AX焦点数在照后0.5h最高，随后下降，且无反弹，符合DNA DSB的修复动力学特征。 3、Western blotting和qRT-PCR结果显示Chk2稳定过表达和沉默的HeLa细胞系构建成功；流式细胞仪结果显示Chk2过表达野生型(WT)和持续激活型(T68D) HeLa细胞G2/M期延长，而过表达持续抑制型(T68A) HeLa细胞对其周期无明显影响；Chk2过表达提高了电离辐射引起的HeLa细胞G2/M期阻滞。 4、Chk2沉默HeLa细胞细胞周期进程加快，Chk2沉默导致HeLa细胞增殖速度加快，降低了电离辐射引起的G2/M期阻滞，引起电离辐射诱导的细胞凋亡率降低以及p53和pig3蛋白表达水平的下调，且对肿瘤治疗药物紫杉醇的敏感性降低。 5、在有丝分裂期，Chk2pT68和γH2AX高表达，DNA-PKcs活性抑制导致Chk2pT68和γH2AX表达水平下降，Chk2沉默同样导致γH2AX表达水平下降。 6、DNA-PKcs沉默或活性抑制的HeLa细胞有丝分裂异常比例增加，包括出现较多有丝分裂中期的misalign chromosome、后期的lagging chromosome以及有丝分裂灾变死亡等有丝分裂异常现象。 结论： 1、将γH2AX作为判断DNA DSB发生和修复效率的分子标志物时，需要综合考虑细胞周期变化的影响因素；γH2AX适合作为1Gy以下低剂量照射的DNADSB的分子标志物； 2、成功构建了稳定过表达Chk2野生型和突变型的HeLa细胞系以及稳定沉默Chk2的HeLa细胞系；Chk2影响细胞周期G2/M期进程，且依赖于Thr68位点的磷酸化；Chk2调控p53介导的细胞凋亡，Chk2沉默导致细胞凋亡率降低；Chk2沉默导致HeLa细胞对靶向细胞周期的抗肿瘤药物紫杉醇的敏感性降低。 3、Chk2调控有丝分裂进程的上游分子主要是DNA-PKcs，有丝分裂期H2AX的磷酸化主要受DNA-PKcs-Chk2信号通路调控。
[Abstract]:Objective:
Observe the formation of G2/M phase gamma H2AX focal point in cell cycle, explore the regularity of H2AX phosphorylation related to the mitosis process, analyze the rationality of gamma H2AX as a DNA DSB damage and repair molecular marker, establish a Chk2 stable over expression and silent cell line, to study the process of mitosis and the G2/M phase arrest induced by ionizing radiation. The effects of apoptosis and drug sensitivity on tumor therapy provide ideas and experimental evidence for finding new targets for tumor radiotherapy and chemotherapy.
Method锛

本文编号：1848771