聚-ADP-核糖基化在六价铬致人支气管上皮细胞损伤中的作用

发布时间：2018-05-07 17:24

  本文选题：Cr(Ⅵ)/六价铬 + 人支气管上皮细胞(16HBE细胞)　； 参考：《广西医科大学》2013年硕士论文

【摘要】：1研究背景 鞣革、印染、电子、炼矿等工业行业广泛应用铬的化合物,这些化合物中及生产后形成的六价铬[Cr(Ⅵ)]以“三废”形式大量排放至自然环境。Cr(Ⅵ)化合物是人体极毒物,具有生殖、遗传等多器官、多方面的毒性,被国际癌症研究机构定为人类确定致癌物。 聚-ADP-核糖基化是分子生物学领域的热点之一。此反应是在聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的催化下,使聚腺苷二磷酸核糖多聚体(PAR)共价连接到受体蛋白上去的过程。聚-ADP-核糖基化是蛋白质翻译后的重要修饰方式之一,与细胞的发育、分化、凋亡及多种肿瘤的发生发展等很多重要的生命活动相关。聚-ADP-核糖-蛋白水解酶(PARG)可清除PAR线状和分枝的核糖与核糖基,主要负责水解蛋白受体上大部分ADP-核糖单元。PARP与PARG的活性平衡维持着细胞内聚-ADP-核糖基化的水平,从而保持受体蛋白活性的稳定。 尽管目前国内外对Cr(Ⅵ)的致癌性和聚-ADP-核糖基化的生物效应的研究很多,但尚未见有聚-ADP-核糖基化与Cr(Ⅵ)毒性关系的报道,本研究从分子水平探讨聚-ADP-核糖基化在Cr(Ⅵ)诱导细胞损伤过程中的生物效应,揭示两者可能的关系,为研究Cr(Ⅵ)的细胞损伤提供新的思路。 2研究方法 2.1Cr(Ⅵ)对16HBE的损害及聚-ADP-核糖基化在其中的影响分析 以正常的人支气管上皮细胞(16HBE)及实验室前期构建的PARG基因缺陷的16HBE细胞株(以后简称PARG缺陷细胞)为研究对象,使用梯度浓度Cr(Ⅵ)染毒,CCK-8法检测细胞增殖抑制能力,免疫荧光技术分析PAR表达,流式细胞仪分析细胞周期,ELISA三明治方法和流式细胞仪检测细胞凋亡,单细胞凝胶电泳检测DNA损伤,RT-PCR及Western Blotting分析ATM、P53、K-ras基因在mRNA和蛋白水平的表达变化。 2.2Cr(Ⅵ)作用下16HBE细胞基因组DNA甲基化水平的改变及聚-ADP-核糖基化在其中的影响 Cr(Ⅵ)作用后,免疫荧光技术检测16HBE细胞及PARG缺陷细胞的基因组DNA整体甲基化水平,RT-PCR及Western Blotting分析DNA甲基化相关蛋白酶DNMT1, DNMT3a、DNMT3b、MBD2基因在mRNA和蛋白水平的表达变化。 2.3Cr(Ⅵ)作用下16HBE细胞中PARG功能相关蛋白的筛选及其功能的初步探讨 联合应用2D-DIGE和MALDI-TOF-MS/MS技术识别和鉴定Cr(Ⅵ)染毒后16HBE细胞和PARG细胞的差异蛋白,UniProt搜库获得各差异蛋白功能,对差异蛋白和聚-ADP-核糖基化反应的关系进行简单探讨。 3研究结果 3.1Cr(Ⅵ)对16HBE的损害及聚-ADP-核糖基化在其中的影响分析 两种细胞内PAR的生成均与Cr(Ⅵ)存在剂量效应,PARG缺陷细胞内PAR基础水平明显高于16HBE细胞且降解时间更长；两种细胞的周期变化无异,都出现了S期阻滞；PARG缺陷细胞的凋亡明显少于16HBE细胞的,DNA损伤受Cr(Ⅵ)的影响也明显小于16HBE细胞,同染毒剂量下ATM.P53基因的表达显著低于16HBE细胞；K-ras的表达无明显变化。 3.2Cr(Ⅵ)作用下16HBE细胞基因组DNA甲基化水平的改变及聚-ADP-核糖基化在其中的影响 16HBE细胞的整体甲基化水平在Cr(Ⅵ)作用下降低,且有剂量依赖,而PARG缺陷细胞染毒后5-mC荧光强度改变不明显；16HBE细胞几个检测基因的mRNA和蛋白水平表达都出现了存在剂量效应的明显下降；PARG缺陷细胞的DNMT3b和MBD2基因的表达与对照相比无差异,DNMT1和DNMT3a的表达存在Cr(Ⅵ)剂量依赖的下降,但降低幅度均比16HBE小。 3.3Cr(Ⅵ)作用下16HBE细胞中PARG功能相关蛋白的筛选及其功能的初步探讨 2D-DIGE识别出26个差异蛋白,MALDI-TOF-MS/MS鉴定出其中9个,分别为ATP synthase subunit d；pyruvate kinase；cofilin-1； stress-induced-phosphoprotein1；thyroid receptor interactor； thioredoxin-dependent peroxide reductase； aldolase A； histone H2A.2；40S ribosomal protein S19； endoplasmic reticulum resident protein29。UniProt搜库发现其中ATP synthase subunit d:pyruvate kinase； Stress-induced-phosphoprotein1； aldase A四个蛋白均具有调节能量代谢的功能。 4结论 4.1Cr(Ⅵ)对16HBE细胞有明显的损伤作用,而缺陷PARG基因能对抗此作用,减少DNA损伤,改善细胞存活。 4.2缺陷PARG基因能调节DNA甲基转移酶的活性,对抗Cr(Ⅵ)诱导的广泛基因组低甲基化,维持16HBE细胞的基因组整体甲基化水平。 4.3通过影响能量代谢途径发挥保护作用可能是聚-ADP-核糖基化对抗Cr(Ⅵ)毒害作用的主要途径之一。
[Abstract]:1 Study Background


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本文编号：1857800