微囊藻毒素LR对大鼠睾丸支持细胞c-jun、c-fos基因表达的影响及机制研究
本文选题：微囊藻毒素 + 支持细胞 ； 参考：《重庆医科大学》2012年硕士论文
【摘要】：背景与目的 微囊藻毒素（mircrocystins, MCs）是由水体中蓝藻类所产生的具有生物活性的单环七肽化合物，具有多种同分异构体，MC-LR是微囊藻毒素中毒性最强的一种。目前蓝藻毒素家族中唯有微囊藻毒素被世界卫生组织（WHO）评估为国际性的健康危险因素，它广泛分布在淡水湖泊及池塘水库中，能导致急性肝损伤并且是活跃的促肿瘤因子，已经被国内外广泛研究。肝肾是其主要的靶器官，目前，MCs引起的生殖毒性的研究报道还很少，且主要是引起一些形态学及激素水平的改变。从细胞及基因水平研究MC-LR对雄性生殖器官的毒作用和机制的报道鲜有见到。本实验拟通过用MC-LR染毒原代SD大鼠睾丸支持细胞，探讨MC-LR对大鼠睾丸支持细胞的毒性作用及对细胞即刻早期应答基因c-fos、c-jun基因和蛋白表达的影响，阐明MC-LR对支持细胞毒性作用可能的原理及机制。 方法 在体外分离培养大鼠睾丸支持细胞，并用免疫荧光进行鉴定。设置微囊藻毒素-LR药物组（0.5nM，5nM，50nM，500nM）和对照组（0nM）作用于原代支持细胞。通过分别用MC-LR作用于原代支持细胞24h和48h后MTT法测定细胞增殖的情况确定合适的作用时间和有效作用浓度；用FCM法测定细胞的凋亡；用RT-PCR法检测c-jun、c-fos mRNA表达；用Western-blot方法检测c-jun、c-fos的蛋白表达。从而从细胞和基因水平分析MC-LR对大鼠睾丸支持细胞毒性作用及对c-jun、c-fosmRNA及蛋白表达的影响。 结果 实验结果显示，在MTT法中，微囊藻毒素-LR作用于睾丸支持细胞24h和48h后分别检测发现：作用24h时，低剂量组（0.5nM，5nM）与对照组（0nM）相比其活性无明显变化，而高剂量组（50nM，500nM）的活性明显下降，增殖减慢，且变化具有统计学意义(P0.05)；作用48h时，低剂量组（0.5nM，5nM）与对照组（0nM）相比其活性无明显变化，而高剂量组（50nM，500nM）的活性显著下降，变化具有统计学意义且500nM组差异有更显著的变化(P0.01)。遂选用高剂量组和对照组作为后续实验的作用时间，48h为作用浓度进行后续的实验。流式细胞术（FCM）检测结果发现高剂量组微囊藻毒素-LR能够引起明显的细胞凋亡，有统计学意义(P0.05)，低剂量组变化则不显著。RT-PCR法检测结果显示，，高剂量组的支持细胞出现c-jun、c-fos基因表达上调，具有统计学意义。Western-blot方法检测到c-jun、c-fos蛋白表达上调，上调结果具统计学意义。 结论 微囊藻作用于SD大鼠原代支持细胞后引起支持细胞的增殖抑制和细胞凋亡；刺激了c-fos和c-jun基因和蛋白的表达上调，推测c-fos和c-jun表达上调改变转录调节通路而引起支持细胞增殖抑制和促进凋亡，最终导致生殖发育损伤。
[Abstract]:Background and purpose Microcystins (MCss) are bioactive monocyclic heptopeptide compounds produced by cyanobacteria in water. MC-LR with multiple isomers is one of the most toxic microcystins. At present, only microcystin in the cyanobacterial toxin family is assessed as an international health risk factor by the World Health Organization (WHO). It is widely distributed in freshwater lakes and reservoirs and can cause acute liver injury and is an active tumor-promoting factor. Has been widely studied at home and abroad. Liver and kidney are the main target organs. There are few studies on the reproductive toxicity caused by MCs, and some morphological and hormone changes are mainly caused. Studies on the toxic effects and mechanisms of MC-LR on male reproductive organs at cell and gene level are rarely reported. The purpose of this study was to investigate the toxicity of MC-LR to rat testicular Sertoli cells and the effect of MC-LR on the expression of c-fos-c-jun gene and protein in rat testicular Sertoli cells. To elucidate the possible mechanism of the cytotoxicity of MC-LR to Sertoli cells. Method Rat testicular Sertoli cells were isolated and cultured in vitro and identified by immunofluorescence. The primary Sertoli cells were treated with the microcystin-LR drug group (0.5nM) and the control group (50nM). After treated with MC-LR for 24 h and 48 h, the proliferation of primary Sertoli cells was determined by MTT method. The appropriate time and effective concentration of cell proliferation were determined by FCM assay. The expression of c-junn c-fos mRNA was detected by RT-PCR method, and the expression of c-junn c-fos mRNA was detected by RT-PCR assay. The expression of c-junn c-fos was detected by Western-blot. The effects of MC-LR on the cytotoxicity of Sertoli cells and the expression of c-junn c-fos mRNA and protein in rat testis were analyzed at cell and gene levels. Result The results showed that in MTT assay, the activity of microcystin-LR in testicular Sertoli cells was not significantly changed compared with that of the control group at 24h and 48h after exposure to microcystin-LR. However, the activity of 50nM (500nM) in the high dose group was significantly decreased, the proliferation was slowed down, and the change was statistically significant (P0.05N). At 48h, the activity of the low dose group (0.5nM) did not change significantly compared with the control group (0nM), but the activity of the high dose group (50nM) decreased significantly, and the activity of the low-dose group decreased significantly compared with the control group (P0.05nM). The change was statistically significant and the difference in 500nM group was more significant (P 0.01). The high dose group and the control group were selected as the follow-up experiment for 48 hours. Flow cytometry (FCM) showed that microcystin-LR could induce apoptosis in high dose group (P 0.05), but not in low dose group (P 0.05). The expression of c-junn c-fos gene was up-regulated in Sertoli cells of high dose group, and the expression of c-junn c-fos protein was detected by Western-blot. Conclusion Microcystis can inhibit the proliferation and apoptosis of Sertoli cells after acting on primary Sertoli cells of SD rats, and stimulate the up-regulation of the expression of c-fos and c-jun genes and proteins. It is speculated that the up-regulation of c-fos and c-jun may induce the proliferation inhibition and apoptosis of Sertoli cells and eventually lead to reproductive development damage.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R114
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