锑诱导的氧化应激在呼吸系统细胞损伤中的作用研究

发布时间：2018-06-14 11:36

本文选题：三氯化锑 + 呼吸系统　；参考：《浙江大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的锑是一种银白色重金属,其化合物被广泛应用于颜料、陶瓷、烟火、玻璃、阻燃剂和汽车刹车片等器材的制造。随着锑矿开采、冶炼及锑加工相关产业的迅速发展,大量锑被释放到大气中,使职业性锑暴露人群增加,其健康危害越来越受关注。职业性锑暴露主要经呼吸道进入人体,可引起上呼吸道刺激症状和肺损伤。然而,目前关于锑与职业人群呼吸系统健康效应的研究主要集中在流行病学调查方面,毒性机理研究较少,缺乏细胞和分子水平的机制解释。本学位论文以三氯化锑(SbCl_3)为研究对象,分析锑暴露在肺腺癌上皮细胞A549和支气管上皮细胞BEAS-2B两种呼吸系统细胞模型中的生物学效应,探究锑所致的细胞氧化应激机制,并通过干预不同来源的氧化应激来进一步验证,从而确立氧化应激在锑致呼吸系统细胞损伤中的作用,为锑致呼吸系统损伤的干预提供实验依据。方法首先采用CCK-8检测细胞活力、PI染色结合细胞流式检测细胞周期、Annexin-V染色结合细胞流式检测细胞凋亡、DCFH-DA探针孵育结合细胞流式检测细胞ROS水平等方法,探究锑处理后细胞产生的生物学效应。由于细胞内ROS的主要来源为胞浆NADPH氧化酶(NOX)家族或线粒体,本论文进一步采用胞浆ROS探针DHE染色、线粒体ROS探针MitoSOXTM染色结合细胞流式检测、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹等技术分析胞浆、线粒体产生ROS相关关键分子表达水平。最后,采用NADPH氧化酶抑制剂DPI和线粒体ROS清除剂Mito-TEMPO预处理细胞后再进行锑处理,证实不同氧化应激途径在锑致细胞损伤效应中的贡献。结果1.锑对A549细胞的毒性效应(1)CCK-8实验结果显示,锑处理24h后可致A549细胞活力下降;利用流式细胞仪对细胞凋亡率进行检测,发现细胞凋亡率无明显上升;PI染色细胞周期检测显示,细胞在G2/M期显著阻滞;蛋白免疫印迹检测证明,细胞相关周期蛋白CyclinA、CyclinB及蛋白激酶Cdk2、Cdk1表达均下调。(2)DCFH-DA探针孵育结合细胞流式检测显示,锑处理后可引起A549细胞ROS水平增加,即诱发氧化应激;加入抗氧化剂NAC处理后,能够显著减轻细胞G2/M期阻滞,使细胞活力恢复。(3)胞浆ROS探针DHE染色检测发现,A549细胞胞浆ROS水平没有明显变化,NADPH氧化酶(NOX)家族成员NOX1、NOX2、NOX5的mRNA及蛋白水平均无明显变化;使用NADPH氧化酶抑制剂DPI处理细胞后,细胞活力并未出现显著回复。线粒体ROS探针MitoSOXTM染色结合细胞流式检测显示,A549细胞线粒体mtROS水平升高;使用线粒体ROS特异性清除剂Mito-TEMPO处理后,细胞周期阻滞减轻,周期蛋白及蛋白激酶表达恢复,细胞活力得到回复。2.锑对BEAS-2B细胞的毒性效应(1)CCK-8实验结果显示,锑处理24h后可致BEAS-2B细胞活力下降;利用流式细胞仪检测细胞凋亡率,发现锑处理后细胞凋亡率显著增加。(2)DCFH-DA探针孵育结合细胞流式检测显示,锑处理后可引起BEAS-2B细胞ROS水平增加;加入抗氧化剂NAC处理后,能够显著降低细胞凋亡率,恢复细胞活力。(3)胞浆ROS探针DHE染色检测发现,BEAS-2B细胞胞浆ROS水平上调,NADPH氧化酶家族NOX1、NOX5的mRNA及蛋白水平均上调;使用DPI处理细胞后,细胞活力部分回复。采用MitoSOXTM染色结合细胞流式检测发现,细胞线粒体mtROS水平升高;Mito-TEMPO处理后细胞活力部分回复。同时采用DPI和Mito-TEMPO预处理BEAS-2B细胞后,细胞凋亡率显著降低,细胞活力得到回复。结论(1)锑暴露诱导A549细胞产生ROS,并导致细胞周期阻滞于G2/M期,细胞活力下降。(2)线粒体ROS清除剂能显著回复锑暴露引起的A549细胞周期阻滞和细胞活力下降,而NADPH氧化酶抑制剂则没有类似回复效应,说明线粒体ROS在锑诱导的A549细胞损伤中起主要作用。(3)锑暴露诱导支气管上皮BEAS-2B细胞产生ROS,使细胞活力下降,并诱导细胞凋亡;(4)线粒体ROS清除剂和NADPH氧化酶抑制剂预处理能抑制锑暴露引起的BEAS-2B细胞损伤,提示线粒体和胞浆NADPH氧化酶均为锑引起的BEAS-2B细胞氧化应激产生的主要来源。综上,本论文研究证明:氧化应激是锑发挥毒性作用的机制之一;针对氧化应激产生的不同来源进行干预,调控细胞内活性氧的生成,有助于促进呼吸系统上皮细胞修复和存活,对锑引起的呼吸系统损伤起到保护作用。
[Abstract]:Objective To study the biological effects of antimony on the apoptosis of lung adenocarcinoma epithelial cells ( A549 ) and bronchial epithelial cells ( BEAS - 2B ) . ( 2 ) After treated with anti - oxidant NAC , the cell viability of BEAS - 2B cells increased . After treated with the inhibitor of NADPH oxidase , the cell viability of BEAS - 2B cells was increased . ( 2 ) mitochondrial ROS scavenging agents can significantly restore the cell cycle arrest and cell viability of A549 cells induced by antimony exposure , while NADPH oxidase inhibitors do not have similar recovery effects , suggesting that mitochondrial ROS play a major role in antimony - induced oxidative stress in BEAS - 2B cells .
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114

【参考文献】