基于胞质分裂阻滞微核细胞组学试验的两类纳米材料遗传毒作用特征研究

发布时间：2018-06-26 06:01

本文选题：量子点 + 树枝状聚合物　；参考：《第二军医大学》2014年博士论文

【摘要】：研究目的纳米材料(Nanomaterial)是运用纳米技术制造出来的具有纳米尺度特殊理化性质的物质。由于纳米物质具有很多与常规尺度物质不同的物理化学特性和生物学效应，其是否会导致与常规尺度物质不同或新的有害效应；现行的毒性评价方法能否足以评价其安全性，成为当前毒理学研究的前沿和热点问题之一。遗传毒性在安全性评价中至关重要，因为遗传毒性不仅关乎接触个体的自身健康，甚至影响其后代健康。而纳米材料由于尺寸小、比表面积高，再加上其表面电荷及金属污染物残留，致使其在引发遗传毒效应机制上可能与常规物质有所不同。现有的研究资料显示：现行常规物质遗传毒性评价方法可能无法有效、可靠地评价纳米材料的遗传毒性，因此，鉴于其重要性和复杂性，作为纳米材料特异毒效应之一的遗传毒性，现已发展成一个专门的亚分支研究领域—纳米遗传毒理学（Nanogenotoxicology）。要回答现行方法是否适用于纳米材料遗传毒性的评价，我们认为可能有赖于对纳米材料遗传毒作用机制和特点的阐明，有赖于对纳米材料遗传毒作用与其理化特性关系的揭示。目前认为纳米材料可能的遗传毒作用机制主要包括两方面，一是通过诱导产生活性氧导致遗传物质损伤；二是直接作用于纺锤体、着丝粒导致染色体分离等异常。胞质分裂阻滞微核细胞组学试验（Cytokinesis—blockmicronucleus cytome assay, CBMN Cyt assay)作为检测染色体不稳定性的细胞组学试验，它可分析Ⅰ和Ⅱ型微核、核质桥、核芽等多个遗传终点，涵盖了染色体断裂和丢失，DNA错误修复、染色体重组或端粒末端融合以及基因扩增和/或基因量(gene dosage)改变。胞质分裂阻滞微核细胞组学试验覆盖了纳米材料可能的两类遗传毒作用机制，且试验条件相对单一，避免了多组合试验方法剂量、体系不一致的问题。因此，本研究拟采用胞质分裂阻滞微核细胞组学试验，从多遗传终点和遗传毒作用机制角度出发，通过分析、比较量子点硫化镉（Nanoscale cadmium sulfide,简写为Nanoscale CdS）与常规尺度硫化镉（Bulk cadmium sulfide,简写为BulkCdS）的遗传毒作用特征，5种代表性树枝状聚合物(Dendrimer)的遗传毒作用特征研究以及量子点硫化镉（Nanoscale CdS）与丝裂霉素C（MMC）、纳米氧化锌（Nanoscale zinc oxide，简写为Nanoscale ZnO）联合遗传毒性的研究，较全面地分析纳米材料遗传毒性的剂量—效应和时间—效应关系。揭示两类纳米材料代表物的遗传毒作用特征，为纳米材料遗传毒性评价方法的选择提供科学依据。研究方法细胞：采用小鼠淋巴瘤L5178Y细胞作为受试细胞，此细胞株已进行核型鉴定，购自中科院上海生命科学研究院细胞所。纳米材料：LumidotTMCdS-6，quantum dot nanoparticles kit购自西格玛公司（Sigma-Aldrich），此量子点硫化镉纳米材料试剂组，包含6个不同荧光发射波长的量子点硫化镉甲苯溶液，其最大荧光发射波长均处于紫外区。测试的Lumidot CdS380粒径1.6nm，其表面为十八烯酸包被，可稳定地分散于甲苯溶液中。 5种代表性的树枝状聚合物亦购自Sigma-Aldrich，包括：聚丙烯亚胺树枝状大分子，4胺基，1代（DAB-Am-4，polypropyleniminetetramine dendrimer, generation1），分子量316.53g/mol，分子式为C16H40N6；聚酰胺-胺树枝状大分子，乙二胺核，5代溶液（PAMAM dendrimer，ethylenediamine core, generation5.0solution），分子量28824.81g/mol，分子式为C1262H2528N506O252C1262H2528N506O252； 2,2-二羟甲基丙酸聚酯树枝状大分子，16羧基，1胺（Polyester bis-MPAdendron，16carboxyl,1amine，简写为bis-MPA dendron）；超支化2,2-二羟甲基丙酸聚酯，64羟基，4代（Hyperbranched bis-MPApolyester-64-hydroxyl，generation4，简写为ALH-64-OH）；聚乙二醇树枝状大分子，16乙炔基，3代（Poly(ethylene glycol)，16acetylenedendron, generation3）。试验方法：取对数生长期的培养细胞接种于24孔板中，调节细胞密度至4×105/ml，每孔加入2.45ml的细胞悬液和50μl的受试物，阴性对照为50μl的细胞培养基，阳性对照加50μl的丝裂霉素C（MMC，终浓度为0.1μg/ml）。每组设两个复孔，混匀后置于37℃，5%CO2培养箱中培养4h，然后每孔再加入20μl的细胞松弛素B （Cytochalasin B），终浓度为4.5μg/ml，继续培养24h。离心收获细胞，然后用0.075M的氯化钾（KCl）低渗处理两次，每次7分钟；再用甲醇、冰醋酸体积比3：1的固定液进行固定、滴片，自然晾干，每孔制2~3张片。最后用10%的吉姆萨染液（Giemsa）染色15min，观察、计数。剂量设置根据受试物对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞的细胞毒性试验结果，以半数抑制浓度（IC50值）为依据，最高剂量组为其IC50值的1/3~1/2；再用细胞培养液进行倍比稀释，共设5个剂量浓度，最低剂量组浓度为IC50值的1/48~1/32。每个剂量组设两个复孔，每孔制2~3张片。每个剂量组计数5张片，共计10000个双核细胞（2000个双核细胞/张），计数其中出现的Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥及核芽数。Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥及核芽的界定标准参照Fenech等人的微核组学操作程序。直径小于主核1/4的微核界定为Ⅰ型微核；主核直径1/4~1/2的微核则划分为Ⅱ型微核。结果（一）量子点硫化镉与常规尺度硫化镉遗传毒性的比较在终浓度分别为0.0063μg/ml，0.0125μg/ml，0.025μg/ml，0.05μg/ml，0.1μg/ml的硫化镉给药剂量下，常规尺度硫化镉在0.0125μg/ml的剂量就可诱导细胞产生总微核、Ⅰ型微核和Ⅱ型微核效应；而剂量增加到0.025μg/ml及以上，除总微核、Ⅰ型微核和Ⅱ型微核数增高外，核质桥及核芽数亦显著性增加，且存在明显地剂量-反应关系。而纳米尺度的量子点硫化镉在0.0063μg/ml剂量时，却抑制细胞产生总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核和核质桥效应；而到0.0125μg/ml剂量时可诱导细胞核芽数增多，0.025μg/ml剂量引发总微核和核芽数增高，0.05μg/ml及以上剂量则诱导细胞出现全部四类效应。相同剂量水平的量子点与常规尺度硫化镉比较结果显示：常规尺度硫化镉诱导细胞产生的Ⅱ型微核和核质桥数显著高于量子点硫化镉；而量子点硫化镉诱导细胞产生的核芽数显著高于常规尺度。从时间-效应（9h，18h，27h和36h）上来看，在0.05μg/ml的剂量水平，无论常规尺度还是纳米尺度的硫化镉，每个时间点的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽数的差异均具有统计学意义；常规尺度硫化镉的各项指标在18h附近达到峰值；而量子点硫化镉在27h最高。（二）5种树枝状聚合物的遗传毒性 1.聚丙烯亚胺树枝状大分子，4胺基，1代（DAB-Am-4，polypropyleniminetetramine dendrimer, generation1）给予受试细胞终浓度分别为0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml的聚丙烯亚胺树枝状大分子，4胺基，1代。结果显示：0.5μg/ml的聚丙烯亚胺树枝状大分子，4胺基，1代可诱导细胞出现核芽效应；在1μg/ml及以上剂量，可进一步诱发受试细胞总微核、Ⅰ型微核和Ⅱ型微核数升高，且受试物的给予剂量与各效应间存在明确的剂量-反应关系。时间-效应分析结果显示：2μg/ml的聚丙烯亚胺树枝状大分子，4胺基，1代作用9h，18h，27h和36h，这四个时点的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽效应差异均具有统计学意义；各项指标均在18~27h间达到峰值。 2.聚酰胺-胺树枝状大分子，乙二胺核，5代溶液（PAMAM dendrimer，ethylenediamine core, generation5.0solution）给予受试细胞浓度分别为0.625μg/ml，1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml的聚酰胺-胺树枝状大分子，乙二胺核，5代溶液，结果显示：1.25μg/ml的聚酰胺-胺树枝状大分子，乙二胺核，5代溶液即可诱导受试细胞出现核芽；2.5μg/ml及以上剂量可进一步诱使细胞出现总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核和核质桥等全部四类效应，且存在明显地剂量-反应关系。时间-效应分析结果显示：在5μg/ml剂量下，聚酰胺-胺树枝状大分子，乙二胺核，5代溶液在9h，18h，27h和36h四个时点引发的总微核、Ⅰ型微核、核质桥和核芽效应差异均具有统计学意义，且在18~27h达到峰值；而四个时点Ⅱ型微核无明显差异。 3.2,2-二羟甲基丙酸聚酯树枝状大分子，16羧基，1胺（Polyester bis-MPAdendron，16carboxyl,1amine，bis-MPA dendron）给予受试细胞终浓度分别为25μg/ml，，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml和800μg/ml的2,2-二羟甲基丙酸聚酯树枝状大分子，16羧基，1胺。结果显示：50μg/ml的2,2-二羟甲基丙酸聚酯树枝状大分子，16羧基，1胺可诱发受试细胞出现Ⅰ型微核和核芽效应；100μg/ml及以上剂量可进一步诱发细胞的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核和核质桥数显著性增高，且存在明确的剂量-反应关系。从时间-效应上分析：9h，18h，27h和36h四个时点，200μg/ml的2,2-二羟甲基丙酸聚酯树枝状大分子，16羧基，1胺诱发受试细胞出现的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽数的差异均具有统计学意义。 4.超支化2,2-二羟甲基丙酸聚酯，64羟基，4代（Hyperbranched bis-MPApolyester-64-hydroxyl，generation4，ALH-64-OH）给予受试细胞终浓度分别为62.5μg/ml，125μg/ml，250μg/ml，500μg/ml和1000μg/ml的超支化2,2-二羟甲基丙酸聚酯，64羟基，4代，结果发现在终浓度为125μg/ml的超支化2,2-二羟甲基丙酸聚酯，64羟基，4代溶液中，受试细胞出现核质桥数显著性增多；在终浓度为250μg/ml及以上剂量时，受试细胞进一步出现总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核和核芽数显著性增高，且存在明确的剂量-反应关系。从时间-效应（9h，18h，27h和36h）上来看，在剂量为500μg/ml的超支化2,2-二羟甲基丙酸聚酯，64羟基，4代作用下，各时点出现的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽数的差异均具有统计学意义；各项指标均在18~27h达到峰值。 5.聚乙二醇树枝状大分子，16乙炔基，3代（Poly(ethylene glycol)，16acetylenedendron, generation3）给予受试细胞浓度分别为0.625μg/ml，1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml和10mg/ml的聚乙二醇树枝状大分子，16乙炔基，3代，结果显示2.5mg/ml的聚乙二醇树枝状大分子，16乙炔基，3代可诱发受试细胞出现总微核、Ⅰ型微核数增高；10mg/ml的聚乙二醇树枝状大分子，16乙炔基，3代可诱发受试细胞出现总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核和核芽数增加，且各类效应与给药剂量间存在剂量-反应趋势。（三）量子点硫化镉与丝裂霉素C（MMC）、纳米氧化锌的联合遗传毒性不论在0.0031μg/ml量子点CdS剂量组，还是在0.0063μg/ml剂量组中，受试细胞的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核和核质桥数均出现下降，说明低剂量量子点CdS可能会提高DNA的复制稳态，导致染色体断裂、丢失，染色体重组以及DNA错误修复或端粒末端融合减少。联合给予试验结果显示：不论是对于强阳性致突变物丝裂霉素C，还是纳米氧化物阳性代表纳米氧化锌而言，低剂量量子点CdS与之联合染毒，均可使受试细胞的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽量显著地下降；且低剂量量子点CdS与丝裂霉素C、纳米氧化锌的联合给予剂量与各效应指标间存在明显地剂量-反应趋势。与0.1μg/ml的阳性对照MMC单独暴露相比，0.0063μg/ml的量子点CdS与之联合染毒可使受试细胞的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽数均显著地降低，而0.0031μg/ml的量子点CdS与0.1μg/ml的MMC联合染毒组，受试细胞的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽数进一步明显地下降，Ⅱ型微核数降至与阴性对照相比，亦无明显差异。浓度为0.0031μg/ml、0.0063μg/ml的量子点CdS与0.05μg/ml的MMC联合染毒，结果显示：与0.1μg/ml的MMC相比，0.0063μg/ml的量子点CdS与0.05μg/ml的MMC联合染毒抑制受试细胞的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽数均显著地降低，核质桥与阴性对照相比差异无统计学意义；而0.0031μg/ml的量子点CdS与0.05μg/ml的MMC联合染毒组，受试细胞的各效应指标进一步降低，核质桥、核芽数与阴性对照相比，亦无明显的差异。而对于纳米氧化物的阳性代表纳米ZnO而言，终浓度0.0063μg/ml的量子点CdS与5μg/ml的纳米ZnO联合染毒组中受试细胞的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽数，与5μg/ml的纳米ZnO单独暴露相比均显著地降低，而0.0031μg/ml的量子点CdS与5μg/ml的纳米ZnO联合染毒可使受试细胞的总微核、Ⅰ型微核和核芽数进一步降低，Ⅱ型微核数降至与阴性对照相比无明显差异。 0.0063μg/ml，0.0031μg/ml的量子点CdS与2.5μg/ml的纳米ZnO联合染毒，结果显示：与2.5μg/ml的纳米ZnO相比，0.0063μg/ml的量子点CdS与2.5μg/ml的纳米ZnO联合染毒可诱发受试细胞的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核质桥和核芽数均显著地降低，其中总微核、Ⅱ型微核、核质桥及核芽数与阴性对照相比无明显差异；而0.0031μg/ml的量子点CdS与2.5μg/ml的纳米ZnO联合染毒组，受试细胞的各效应指标进一步降低，仅诱发受试细胞的Ⅰ型微核数略高于阴性对照；其他各效应指标与阴性对照相比，差异均无统计学意义。结论（一）量子点硫化镉与其相应常规尺度的材料相比，在毒作用性质方面存在一定的差异。常规尺度硫化镉可直接诱导DNA损伤，且损伤效应与常规尺度硫化镉的给予剂量间存在明确的剂量-反应关系；而量子点硫化镉则具有双向调控DNA复制稳态功能，低剂量具有毒物兴奋效应，抑制DNA损伤；高剂量则诱导DNA损伤。在毒作用特征上，常规尺度硫化镉先诱发标志染色体断裂和丢失的Ⅰ型微核、Ⅱ型微核，伴随剂量的增加进一步引起总微核、核质桥和核芽效应；而量子点硫化镉则先诱导标志基因扩增的核芽；伴随剂量增加，进一步引起总微核、I型微核、II型微核和核质桥等效应。从毒作用特征上的差异，可以推断量子点硫化镉引发DNA损伤的作用机制与常规尺度硫化镉不同，常规尺度硫化镉可能主要通过氧化损伤和抑制DNA的特异性修复系统产生遗传毒效应；而量子点硫化镉可能通过与DNA直接作用产生遗传毒效应。而作用剂量比较显示：常规尺度硫化镉诱导DNA损伤的等效应剂量明显低于量子点硫化镉，且损伤效应出现的时间较早，损伤程度更严重。（二）5种代表性树枝状聚合物的毒作用性质相似，均可直接导致DNA损伤，但其诱导DNA等效应损伤的剂量顺序为聚乙二醇树枝状大分子，16乙炔基，3代（Poly(ethylene glycol)，16acetylene dendron, generation3）超支化2,2-二羟甲基丙酸聚酯，64羟基，4代（Hyperbranched bis-MPA polyester-64-hydroxyl，generation4）2,2-二羟甲基丙酸聚酯树枝状大分子，16羧基，1胺（Polyesterbis-MPA dendron，16carboxyl,1amine）聚酰胺-胺树枝状大分子，乙二胺核，5代溶液（PAMAM dendrimer， ethylenediamine core, generation5.0solution）聚丙烯亚胺树枝状大分子，4胺基，1代（DAB-Am-4，polypropylenimine tetraminedendrimer, generation1）。在毒作用特征上，属于单分散性树枝状聚合物类的两种树枝状聚合物（聚丙烯亚胺树枝状大分子，4胺基，1代和聚酰胺-胺树枝状大分子，乙二胺核，5代溶液）均先诱导标志基因扩增的核芽，随剂量的增加进一步引发其它毒效应。树突型单分散性楔形树枝状聚合物类的2,2-二羟甲基丙酸聚酯树枝状大分子，16羧基，1胺则先诱导标志染色体断裂的Ⅰ型微核和标志基因扩增的核芽增加，伴随剂量的增高进一步诱发全部四类效应。而多分散性树枝状聚合物类的超支化2,2-二羟甲基丙酸聚酯，64羟基，4代则先诱导标志DNA错误修复、端粒末端融合的核质桥，伴随剂量增高进一步引起其它毒效应；聚乙二醇树枝状大分子，16乙炔基，3代先诱导标志染色体断裂的Ⅰ型微核，最高作用剂量可引起总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核和核芽效应。时间-效应分析显示：5种代表性树枝状聚合物诱发最严重损伤的出现时间集中在18~27h。树枝状聚合物的毒作用性质与其内核和外表面功能团密切相关。（三）不同组合的低剂量量子点CdS与阳性致突变物MMC、纳米氧化物阳性代表纳米ZnO联合染毒试验显示：低剂量量子点CdS可拮抗阳性受试物MMC、纳米ZnO的遗传毒效应，抑制受试细胞的总微核、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核芽和核质桥数，导致受试细胞的染色体断裂、丢失，DNA错误修复、染色体重组和端粒末端融合以及基因扩增减少。证明低剂量量子点CdS可能具有毒物兴奋效应，抑制DNA损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114

【参考文献】