【摘要】：目的：赭曲霉毒素A（OchratoxinA, OTA）是由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌株产生的一种真菌毒素，其污染非常普遍，在粮食作物和食品中存在非常广泛。OTA的主要毒性作用器官是肾脏，OTA可能是巴尔干地方性肾病的主要致病原，1993年国际癌症研究中心IARC将OTA列为“可能的人类致癌物”。除外肾毒性，动物实验研究还发现OTA具有免疫毒性、肝毒性、神经毒性、致突变性、致畸性和致癌性等生物效应。长期食用OTA污染的饲料，可以诱发F344/N大鼠出现前胃上皮细胞增生和乳腺纤维腺瘤。由于在食物中分布的广泛性，人类很容易长期暴露于OTA的毒性环境中。 研究表明一些真菌毒素的早期毒性作用是通过引起凋亡、增殖抑制或者周期阻滞，比如脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮及烟曲霉毒素B1。我们实验室前期研究工作发现，OTA通过下调人胃黏膜上皮细胞周期调控关键蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达引起细胞G2期阻滞，提示OTA可通过G2期阻滞来发挥其部分毒性作用，在中国仓鼠肺成纤维细胞（V79）及非洲绿猴肾脏细胞（CV-1）中，OTA也通过导致G2期阻滞来发挥其毒性作用。 丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）级联是细胞内重要的信号转导系统之一，参与细胞的各种生理及病理活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。MAPKs家族最主要的成员为ERK（细胞外信号调节激酶）通路，JNK/SAPK（c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶）通路和p38MAPK通路。研究表明在各种刺激因素的作用下，细胞可以通过激活或抑制MAPK信号通路而启动细胞G2期检测点，使细胞发生G2期阻滞。Yang等人发现脱氧雪腐镰刀菌烯醇介导的G2/M阻滞是通过ERK1/2信号通路增强p_21水平实现的。然而，目前有关OTA诱导人胃黏膜上皮细胞G2阻滞的相关分子机制尚不明了。 鉴于MAPK信号通路在细胞周期中的重要作用，我们提出这样的假设，即MAPK信号通路可能参与OTA诱导的人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞。为验证本假设，本实验将观察JNK、ERK和p38MAPK信号通路在OTA诱导的G2期阻滞中的作用，以期揭示OTA诱导体外人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞的可能分子机制。 方法： 1细胞培养与处理 正常人胃黏膜上皮细胞（GES-1）培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2培养，细胞贴壁生长。 选择对数生长期的细胞（传代后24h）随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予OTA，使其终浓度分别为5、10、20μM，溶剂对照组给予终浓度为0.08%的甲醇（每组设平行样本3个），继续培养24h收集细胞进行相关指标检测。 2阻断剂处理 对数生长期GES-1细胞，分别给予10μM SB203580（p38的阻断剂或者10μM PD98059（ERK的阻断剂）预处理30min。实验分为4组，即溶剂对照组、阻断剂组、OTA处理组和阻断剂+OTA处理组。细胞处理24h后收集细胞检测相关指标。 3siRNA转染 分别用100pmol ERK和p38特异性siRNA转染细胞，再加入20μMOTA继续培养24h收集细胞进行相关指标检测。同时转染Negtive controlsiRNA（NC siRNA）作为阴性对照。检测ERK和p38基因被干扰后对OTA诱导的G2期阻滞的影响。 4流式细胞术检测细胞周期（FCM）OTA作用24h后，分别收集各组细胞，PBS洗涤，离心收集细胞，用70%冰乙醇固定检测细胞周期分布情况。 5蛋白免疫印迹（Western blot） OTA处理GES-1细胞24h后，提取细胞总蛋白，用蛋白免疫印迹方法，检测OTA处理后人胃黏膜上皮细胞GES-1中JNK/磷酸化型JNK、ERK/磷酸化型ERK和p_38/磷酸化型p38以及G2期调控蛋白的表达情况。 6免疫共沉淀（IP） 提取细胞总蛋白，120μg各组蛋白加入1μg CyclinB1抗体4℃摇床过夜，进行琼脂糖凝胶电泳检测Cdc2-CyclinB1复合物的形成情况 7统计 采用SPSS13.0软件进行相关分析与单因素方差分析（analysis ofvariance, ANOVA），数据用x±s表示，检验以P0.05为差异有显著性意义。 结果： 1OTA对体外培养GES-1细胞JNK、ERK和p38信号通路的影响 1.1OTA使GES-1细胞内的ERK和p38磷酸化水平升高，对JNK无影响 Western blot结果显示，OTA5、10和20μM处理24h后，p38和ERK磷酸化水平明显高于溶剂对照组（P0.05），而JNK磷酸化蛋白相对表达量与溶剂对照组比较差异无显著性（P0.05）。同时，各OTA处理组细胞内非磷酸化p_38、ERK和JNK蛋白水平均未发生明显变化（P0.05）。 1.2ERK和p38阻断剂可对抗OTA引起的ERK和p38磷酸化水平的升高 结果显示，与OTA20μM处理组相比，ERK的磷酸化水平在PD98059+OTA组明显降低（P0.05）。同样的，SB203580预处理也逆转了OTA引起的p38磷酸化水平的升高（P0.05）。 以上结果表明，OTA处理可以激活GES-1细胞内的p38和ERK信号通路，而对JNK通路并未造成影响。 2阻断ERK信号通路对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响 2.1ERK特异性阻断剂（PD98059）预处理对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响 FCM结果显示，PD98059预处理+OTA20μM组G0/G1期细胞比例较20μM OTA单独处理组明显增加，G2/M期细胞比例则显著降低（P0.05）。表明PD98059可以部分逆转OTA诱导的GES-1细胞G2阻滞。 2.2ERK siRNA干扰对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响 FCM研究结果发现，NC siRNA处理组与溶剂对照组细胞周期分布无明显差异（P0.05）。ERK siRNA转染则可以显著逆转OTA对GES-1细胞周期的影响，即显著了升高G0/G1期细胞比例，降低了G2/M期细胞的比例（P0.05）。表明ERK siRNA转染可部分逆转OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。 上述结果表明ERK信号通路参与OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。 3阻断p38信号通路对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响 3.1p38特异性阻断剂（SB203580）预处理对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响 FCM结果发现，SB203580预处理对细胞周期的影响类似于PD98059，即与OTA20μM处理组相比，SB203580预处理降低了GES-1细胞的G2/M期细胞比例（P0.05）。表明SB203580可以部分逆转OTA诱导的GES-1细胞G2阻滞。 3.2p38siRNA干扰对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响 FCM研究结果发现，NC siRNA处理组细胞周期分布与溶剂对照组相比无明显差异（P0.05）。而p38siRNA转染则显著逆转了OTA导致的G2期阻滞（P0.05）。 以上结果证明p38信号通路参与OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。 4阻断ERK信号通路对OTA诱导的GES-1细胞G2期调控蛋白的影响 4.1ERK特异性阻断剂（PD98059）预处理对GES-1细胞G2期调控蛋白的影响 Western blot结果显示，与20μM OTA处理组相比，PD98059预处理+OTA20μM组G2期相关蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）及磷酸化形式的Cdc25C和Cdc2的表达明显增加（P0.05）。 IP结果显示，PD98059预处理GES-1细胞同时增加了Cdc2-CyclinB1复合物的形成（P0.05）。 表明PD98059预处理可逆转OTA对GES-1细胞G2期调控蛋白表达降低的影响。 4.2ERK siRNA干扰对GES-1细胞G2期调控蛋白的影响 Western blot检测结果显示，ERK siRNA转染可对抗OTA引起的Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白表达的下降（P0.05）。NC siRNA处理组细胞内上述蛋白的相对表达量与溶剂对照组比较差异无显著性（P0.05）。 IP结果显示，NC siRNA处理组细胞内Cdc2-CyclinB1复合物与溶剂对照组相比没有明显差别（P0.05），而与OTA20μM处理组相比，，ERKsiRNA+OTA20μM处理组Cdc2-CyclinB1复合物明显增多（P0.05）。 以上结果提示，ERK信号通路通过调控G2期调控蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达参与OTA诱导的p38-1细胞G2期阻滞。 5阻断p38信号通路对p38-1细胞G2期调控蛋白的影响 5.1p38特异性阻断剂（SB203580）预处理对p38-1细胞G2期调控蛋白的影响 Western blot结果显示，SB203580预处理+OTA20μM组与20μMOTA处理组相比，Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白的表达明显增加（P0.05）。 另外，IP结果显示，与OTA20μM处理组相比，SB203580预处理+OTA20μM处理组Cdc2-CyclinB1复合物明显增多（P0.05）。 5.2p38siRNA干扰对p38-1细胞G2期调控蛋白的影响 Western blot检测结果显示，NC siRNA处理组细胞内Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白相对表达量与溶剂对照组比较差异无显著性（P0.05）。而p38siRNA转染后可以对抗OTA引起的上述蛋白的下降（P0.05）。 IP结果显示，Cdc2-CyclinB1复合物在NC siRNA处理组与溶剂对照组相比没有明显差别（P0.05），而p38siRNA转染显著逆转了OTA20μM引起的Cdc2-CyclinB1复合物的降低（P0.05）。 以上结果提示，p38MAPK信号通路通过调控G2期调控蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达参与OTA诱导的p38-1细胞G2期阻滞。 结论： 1赭曲霉毒素A作用于p38-1细胞24h，可以激活ERK和p38MAPK信号转导通路，对JNK信号通路并未造成影响。 2阻断ERK和p38MAPK信号通路可对抗赭曲霉毒素A对p38-1细胞的G2期阻滞作用。 3阻断ERK和p38MAPK信号通路可对抗赭曲霉毒素A对G2期调控关键蛋白（Cdc2/p-Cdc2、Cdc25C/p-Cdc25C、CyclinB1）和Cdc2-CyclinB1复合物的降低作用。 4ERK和p_38MAPK信号通路通过调控G2期调控蛋白（Cdc25C、Cdc和CyclinB1）的表达参与OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R114
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 吴献伟;杨华;吴丽;薛荣亮;;细胞外信号调节激酶蛋白在全脑缺血再灌注损伤后的表达及与凋亡的关系[J];内蒙古中医药;2010年15期
2 沈梅红;李忠仁;项晓人;牛文民;张春兵;;电针对MCAO大鼠ERK蛋白表达的影响[J];针灸临床杂志;2007年07期
3 吴献伟;吴丽;薛荣亮;;全脑缺血再灌注后磷酸化ERK蛋白的表达及应用PD98059后对其表达的影响[J];实用医技杂志;2008年02期
4 盛宏申,黄维国,王锦铃,姜鸿彦,邱建华;庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮自发修复的分子机制研究[J];中国临床康复;2002年09期
5 郭松;王建超;王芳;;TGF-β和ERK在骨质疏松大鼠骨组织中的表达[J];中国康复;2007年05期
6 张莹;孙黎光;叶丽平;曹师承;王玉;;铅对大鼠神经胶质培养细胞ERK活力及总量的影响[J];毒理学杂志;2007年05期
7 马俊骥;姜慧卿;李芳芳;崔东来;刘丽;扈彩霞;张杰英;;RKIP在胆总管结扎肝纤维化大鼠肝脏组织的表达[J];中国老年学杂志;2008年20期
8 钟华;何芳;胡清华;王振焕;邓峰美;孙志萍;李增春;;血管平滑肌细胞中ERK通路与TGF-β_1/Smad通路的相互作用[J];中国应用生理学杂志;2010年01期
9 章丽霞;刘钧;;细胞外信号调节激酶(ERK)与宫颈癌关系的研究进展[J];川北医学院学报;2010年05期
10 周舟,王小华,Igisu Hideki,林远,楼淑芬,Matsuoka Masato,程天民,余争平;辐射诱导IEC-6细胞MAPK信号转导途径的激活(英文)[J];辐射研究与辐射工艺学报;2002年02期
相关会议论文 前10条
1 梁正贤;刘娜;刘丽梅;柳思佳;雍彦礼;孙伟正;;补肾生血法对慢性再生障碍性贫血患者骨髓ERK号通路相关蛋白表达的影响[A];全国中西医结合血液学学术会议论文汇编[C];2010年
2 周妙妮;许文;付丽芳;洪为松;关翠萍;许爱娥;;HU16培养基对表皮黑素细胞ERK1/2信号通路的激活[A];2010全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2010年
3 Michelle C.Mendoza;Sarah J.Mahoney;Didem Ilter;John Blenis;;Down-regulation of CMTM8 induces EMT-like changes and cell motility through c-MET-ERK signaling[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
4 金龙腾;张和;李昌崇;张维溪;林立;;ERK信号通路在白介素-1β介导人胚肺成纤维细胞增殖和活化中的作用及香菇多糖的调控[A];2011年浙江省医学会儿科学分会学术年会暨儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2011年
5 王新华;王士雯;周荣斌;李泱;李宗斌;赵玉生;朱庆磊;刘昱圻;;地黄低聚糖对体外培养的骨髓间充质干细胞增殖和ERK表达的影响[A];2010全国中西医结合危重病、急救医学学术会议论文汇编[C];2010年
6 王俊英;刘俊岭;陈淑萍;乔丽娜;高永辉;;电针镇痛与海马、下丘脑ERK信号通路的关系的研究[A];第十五届针灸对机体功能的调节机制及针灸临床独特经验研讨会暨第十一届针灸经络学术研讨会会议论文集[C];2010年
7 冯杰;张英杰;吴胜男;邢达;;低功率激光照射通过激活ERK/Sp1信号通路促进血管再生[A];中国光学学会2011年学术大会摘要集[C];2011年
8 凌晴舟;孟程博;吴胜男;邢达;;利用FRET技术实时监测弱激光刺激下ERK和FoxM1的相互作用[A];中国光学学会2011年学术大会摘要集[C];2011年
9 王凌霄;彭代辉;方贻儒;黄建华;;ERK/CREB信号通路磷酸化水平在慢性应激模型大鼠海马中研究[A];中华医学会精神病学分会第九次全国学术会议论文集[C];2011年
10 王桂美;严晓红;陆欢;胡敏;丁雅澜;;硫化氢活化ERK抵抗内质网应激引起的心肌细胞凋亡[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年
相关重要报纸文章 前10条
1 蔡微微;中国缘何不认同G2说[N];中国社会科学院报;2009年
2 记者 莫莉;G2对话有益于全球发展[N];金融时报;2009年
3 冯迪凡;我们离中美G2有多远？[N];第一财经日报;2009年
4 新闻工作者 曹辛;中国外交需要G2[N];经济观察报;2011年
5 本报记者 程明霞 实习生 赵晓琳;伦敦峰会G2走到舞台中央[N];经济观察报;2009年
6 冯迪凡;克鲁格曼：我认为G2的提法是错的[N];第一财经日报;2009年
7 向阳;联想机架服务器旗舰产品R525 G2问世[N];科技日报;2009年
8 北京师范大学政治学与国际关系学院教授、国际事务研究所所长 李兴;中美G2：是抬举,还是“忽悠”[N];中国财经报;2009年
9 储昭根;S＆ED:中美“G2”催化剂[N];中国经营报;2009年
10 本报记者 刘艳;科瑞“签”手G2第一单落户长春[N];人民政协报;2010年
相关博士学位论文 前10条
1 刘密;艾灸促进应激性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜修复作用及其ERK信号转导途径的研究[D];湖南中医药大学;2011年
2 李文毅;Rap1GAP通过ERK和Akt途径抑制内皮细胞增殖、迁移的实验研究[D];华中科技大学;2011年
3 王海涛;PTSD大鼠海马和下丘脑5-HT1A受体活性及前额皮质ERK变化的实验研究[D];中国医科大学;2010年
4 李印;nm23-H1基因转染对人肺癌细胞中Ras-to-MAPK信号传导通路影响的实验研究[D];四川大学;2004年
5 郑旭锐;“肺病及肠”病理变化及相关调控物质和ERK信号通路研究[D];成都中医药大学;2011年
6 刘燕;MEK/ERK信号传导通路在缺氧诱导的外层血—视网膜屏障损伤中的作用[D];中南大学;2012年
7 王秋旭;口腔鳞状细胞癌细胞外信号调节激酶及PTEN蛋白表达的研究[D];中国医科大学;2005年
8 赵黎;HIF-1α/ERK通路在微波辐射致海马神经元线粒体损伤中的作用研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
9 林涛;RKIP调控的Raf/MEK/ERK信号通路在微波辐射诱导PC12细胞凋亡中的作用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
10 胡晓玲;Xc~-转运体和金属蛋白酶参与小脑颗粒神经元同型半胱氨酸引起ERK_(1/2)的磷酸化[D];中国医科大学;2010年
相关硕士学位论文 前10条
1 赵萌;ERK表达及活化在食管癌进展过程中的作用机制研究[D];河北医科大学;2010年
2 刘清南;Adipophilin通过ERK1/2-PPARγ途径促进细胞内脂质蓄积[D];南华大学;2010年
3 许清秀;ERK通路与丙泊酚后处理大鼠的脑保护作用[D];福建医科大学;2011年
4 黄
本文编号：2258351
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yufangyixuelunwen/2258351.html
