氧化石墨烯致秀丽线虫毒效应分子机制及预防策略研究

发布时间：2018-10-08 22:02

【摘要】：背景：氧化石墨烯(GO)是由单层碳原子组成的六角形结构,由于其独特的光、电等特性,使其在生物医药、电子元件,复合材料等领域崭露头角,被认为是生物传感器、药物载体及生物成像等众多研究与应用领域极具潜能的工程纳米材料。GO在给人类带来巨大经济利益和技术突破的同时,也对环境和人类的健康与安全产生了潜在威胁。秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是一种在发育、遗传等研究领域广泛应用的模式动物,具有繁殖周期短、周身透明、成本低廉、遗传背景清楚等众多优良特性,近年来已被成功用于环境毒理、纳米毒理等研究领域。本研究拟利用秀丽线虫在体模型在毒理学研究领域的优势,系统解析GO的致毒效应及可能分子机制,结合化学改造的氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)与植物生物活性分子的特性解析其对GO毒性的可能预防保护作用,以期为GO在生物医药等领域的应用奠定基础。方法：利用秀丽线虫在体评价模型的优势,选择寿命、运动行为、后代数目、肠道ROS诱导、生殖细胞凋亡细胞数等指标作为评价终点,系统解析GO致毒效应的分子机理。通过Rho B荧光探针标记G0分析G0在秀丽线虫体内的转运与分布。分别利用SOLiD和Illumina HiSeqTM 2000测序技术分析G0暴露对秀丽线虫miRNAs和mRNAs表达谱的影响,通过生物信息学、分子生物学与遗传学等手段分析miRNAs和mRNAs在G0毒性调控中的生物学功能。利用改造后的氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)、甘草及其生物活性成分探索化学改造与植物生物活性分子对G0毒性的可能预防保护作用。结果：1、miRNAs对G0致秀丽线虫在体毒效应的调控作用：通过SOLiD测序,在GO暴露秀丽线虫中确定了23个上调和8个下调的miRNAs。通过KEGG信号通路数据库和基因本体论分析发现,这些miRNAs分子可能参与控制多种生物学过程。应用miRNAs突变体,基于寿命及衰老相关表型评价终点的分析,对候选miRNAs分子在G0毒效应中的调控功能进行验证。其中,mir-244和mir-235突变体对G0毒效应表现得比野生型更加敏感,mir-247/797, mir-73/74和mir-231突变体则表现出对G0毒效应的抗性。在秀丽线虫中,miRNAs分子可能通过影响胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路、TOR信号通路和germline信号通路功能从而调控G0缩减寿命的生物效应。2、miRNAs-mRNAs分子网络在G0致秀丽线虫毒效应中的调控作用：利用Illumina HiSeqTM 2000测序技术从G0暴露秀丽线虫中分别鉴定了970个上调和995个下调的mRNAs。鉴于miRNAs可以通过与靶基因结合发挥其生物学功能,基于所获取的差异表达miRNAs和mRNAs,确立了G0毒效应中的miRNAs-mRNAs分子网络。所确立的miRNAs-mRNAs分子网络有助于解释氧化应激、肠道发育与功能和排泄行为在G0毒效应调控中的重要生物学功能。在此miRNAs-mRNAs分子网络中,系列miRNAs可能以JNK信号通路编码基因为靶点调控G0毒效应。在JNK信号通路中,JKK-1和MEK-1作为JNK-1的上游调控分子调控G0毒效应。3、GO致秀丽线虫次级靶器官生殖细胞毒性及分子机制：G0暴露可以诱导秀丽线虫生殖细胞的凋亡。此过程需要核心凋亡分子ced-3和ced-4基因的参与。DNA损伤应答在G0所诱导的生殖细胞凋亡中必不可少。G0暴露可以诱导秀丽线虫中生殖腺分裂细胞中DNA产生损伤,从而阻滞细胞周期。通过miRNAs靶点预测找到了一些可能与G0诱导生殖细胞凋亡相关的miRNAs分子。其中,mir-360突变后生殖细胞凋亡的诱导作用明显高于野生型。因此,miRNAs在G0所诱导的秀丽线虫生殖细胞凋亡中发挥着重要功能,这种功能可能是通过核心凋亡信号通路和细胞周期节点蛋白来发挥的。4、p38信号通路调控G0致秀丽线虫毒效应及其分子机制：G0暴露可以改变p38信号通路编码基因的表达模式,并导致其中PMK-1蛋白表达从细胞质向细胞核转位。sek-1、mek-1和pmk-1突变体呈现出对G0敏感的表型,且sek-1、 mek-1和pmk-1基因突变导致更多G0在动物体内的积累。肠道pmk-1特异性RNAi干扰与全身RNAi对GO的敏感性相似,肠道特异性表达pmk-1可以恢复pmk-1突变体的敏感表型。在G0暴露条件下,pmk-1;mek-1或pmk-1;sek-1双突变体呈现出与pmk-1单突变体类似的表型,暗示mek-1或sek-1作用于pmmk-1上游调控G0毒性。在G0暴露条件下,pmk-1;skn-1双突变体呈现出与skn-1单突变体类似的表型; pmk-1 gst-4呈现出与gst-4单突变体类似的表型,skn-1 gst-4双突变对G0的敏感性与gst-4类似,暗示SKN-1或GST-4在PMK-1下游调控G0毒性,且SKN-1作用于GST-4上游调控G0毒性。5、氮掺杂石墨烯量子点的安全性评价及其细胞学机制：采用延长暴露方式对野生型及sod-2和sod-3敏感突变体进行暴露(sod-2和sod-3基因编码Ms-SODs)。寿命、致死率、生殖和运动行为等评价终点分析显示,氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)对秀丽线虫初次级靶器官的功能并没有产生不良影响,且没有致死效应。此外,在野生型和突变体的后代分析中也没有检测到N-GQDs毒性效应。对野生型和突变体秀丽线虫的分析发现,N-GQDs只分布秀丽线虫的肠道,受精卵及子代中没有检测到N-GQDs的积累。N-GQDs暴露后,野生型与突变体秀丽线虫肠道屏障和排泄行为保持正常。基于所获数据,提出肠道生物屏障与排泄行为生理状态以及相对于GO降低的C=O=C基团是导致N-GQDs难以在动物体内积累的重要原因。6、甘草活性成分甘草酸预防G0致秀丽线虫毒效应及分子机制：甘草(GR)预处理(62.5-125 mg/mL)可以拮抗G0对秀丽线虫初级和次级靶器官的毒效应。在甘草的化学成分(甘草酸、甘草苷和异甘草苷)中,甘草酸是甘草拮抗G0毒效应的主要活性成分。甘草酸预处理可以抑制G0穿过肠道屏障向次级靶器官转运。甘草酸预处理可以抑制肠道ROS的诱导、恢复G0诱导失调的氧化应激相关基因的表达模式。甘草酸预处理还可以恢复G0诱导失调的miRNAs表达模式,且氧化应激相关基因可以作为这些miRNAs分子的潜在靶基因。mir-360突变可以显著增强甘草酸在拮抗GO毒效应中的有益作用。因此,甘草酸可能通过影响氧化应激相关基因及其上游miRNAs分子功能从而抑制G0在秀丽线虫体内的毒性与积累。结论：获得了GO诱导异常表达的miRNAs和lnRNAs谱,并进而提出了可能参与G0毒效应调控的miRNAs-mRNAs分子网络。对于G0毒效应调控具体的分子机制,结果表明凋亡信号通路和细胞周期节点蛋白可能参与了GO生殖毒效应的调控,p38信号通路(SEK-1/MEK-1-PMK-1-SKN-1-GST-4)在GO毒性及转运调控中发挥重要功能。而且,提供证据证明了化学改造或药物干预在预防G0毒效应中的重要价值。
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【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
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本文编号：2258420