【摘要】：研究目的世界卫生组织(WHO)数据统计结果显示,癌症是全球慢性非传染性疾病中仅次于心血管疾病的第二大杀手。在我国,近十年来癌症发病率呈上升趋势,严重危害人体身心健康。目前,化学治疗(Chemotherapy)是癌症治疗的主要手段。环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)是作为一种临床化疗药物,在癌症治疗中取得明显效果,但在杀伤癌细胞的同时往往损害正常细胞,产生不同程度的毒副反应,如降低白细胞水平、免疫抑制、骨髓抑制、消化道症状以及精神萎靡、疲乏无力、脱发、过敏等其他表现。在我国,临床上使用化疗药物治疗肿瘤的同时,往往会联合使用中药提取物或中药制剂以减轻化疗所致的毒副反应,并取得了一定效果。但中药使用依然存在许多问题,其繁多的药物种类限制了有效药物的筛选。大蒜(Garlic)作为一种药食两用的植物,具有多种生物活性成分和营养成分,广泛地应用于疾病预防和治疗以及医疗保健中。研究发现,大蒜具有抗菌消炎、降血脂、降血压、减少血小板积聚、预防心血管疾病以及抗肿瘤等作用。同时,研究发现大蒜所表现出的这些药用价值主要与其所含或能够代谢产生的多种含硫化合物息息相关。二烯丙基三硫(Diallyl Trisulfide,DATS)是从大蒜提取出的主要含硫化合物,是大蒜的主要活性成分。流行病调查及实验研究发现,DATS在人体、动物、细胞水平上对胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌等多种癌症均有预防治疗作用,其作用机制主要包括抑制杀伤肿瘤细胞,诱导肿瘤细胞凋亡;抑制肿瘤细胞转移和浸润;细胞周期阻滞的调节;抗氧化等,而DATS拮抗环磷酰胺化疗引起的毒副作用及其本身的毒性罕见报道。因此,本研究首先采用90天经口染毒途径,观察了 DATS对Wistar大鼠亚慢性毒性反应,进行DATS毒性安全评价;进而建立H22肝癌荷瘤小鼠动物模型,以CTX作为化疗药物模型,选择DATS进行抗肿瘤干预,同时观察DATS的抗肿瘤效果及其对化疗毒副反应的减毒增敏作用,以期为DATS亚慢性毒性安全评价提供实验依据,为DATS作为保健食品开发以及抗肿瘤的辅助性药品开发提供依据。研究方法1 DATS 90天经口染毒亚慢性毒性评价80只Wistar大鼠,雌雄各半,随机分为对照组、30 mg/kg.bw、60 mg/kg.bw、90 mg/kg.bw DATS剂量组,每组20只。动物适应性喂养5天后,将DATS溶于玉米油稀释,经口灌胃给予相应剂量的DATS,灌胃体积为0.5ml/100g.bw,对照组经口灌胃给予等体积的玉米油,每天1次,连续90天。动物一般观察、体重和食物利用率:实验期间,每天观察并记录实验动物状态及异常表现,包括一般表现、行为、中毒及死亡情况。期间每周称一次体重,并加食两次,严格记录动物饲料摄入量和饲料剩余量,并计算食物利用率。血液学指标测定:90天经口染毒结束,各组动物禁食16小时后断头取抗凝血,测定红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、白细胞(WBC)和白细胞分类(淋巴细胞、中性细胞、单核细胞)等指标。血清生化指标测定:90天经口染毒结束,各组动物禁食16小时后断头取血5ml于离心管中,室温静置1小时,3500 r/min离心10 min,分离血清,测定谷草转氨酶活力(AST)、谷丙转氨酶活力(ALT)、尿素氮含量(BUN)、肌酐含量(CREA)、总蛋白含量(TP)、白蛋白含量(ALB)、球蛋白含量(GLB)、总胆固醇含量(CHOL)、甘油三酯含量(TG)和葡萄糖含量(GLU)等指标。脏器系数测定:动物处死后,取肝、肾、脾、胃、卵巢或睾丸称重并计算脏器系数。脏器病理形态学检测:每组随机选取5只动物,取其肝、脾、肾、胃、卵巢或睾丸部分组织置于多聚甲醛中固定,制备石蜡切片,进行HE染色,检测不同剂量组动物脏器病理改变。2 DATS抗肿瘤效果及其CTX化疗所致毒副反应的减毒增敏效果评价荷瘤小鼠模型建立及分组:选用H22肝癌细胞株,接种6-8天左右的种鼠,抽取约5ml腹水于15ml无菌离心管中,腹水呈乳白色,加入无菌生理盐水充分混匀后离心5min,转速为1OOOr/min,离心结束弃上清,洗两次。加入无菌生理盐水制备H22细胞悬液,用台盼蓝染色,进行细胞计数,将其配制成浓度为2×107cells/ml,充分混匀,备用。选用昆明小鼠,用75%酒精消毒接种部位皮肤,每只小鼠皮下接种H22细胞悬液0.2ml于左腋窝下,60min结束全部操作。24小时后将动物编号,随机分组。50只雄性昆明荷瘤小鼠随机分为模型组、25mg/kg.bw CTX 组、50mg/kg.bw DATS 组、CTX+25mg/kg.bw DATS 组和CTX+50mg/kg.bwDATS组,每组10只,第二天开始给药。CTX用生理盐水配制,腹腔注射,DATS溶于玉米油,经灌胃给予,灌胃体积为0.2ml/10g.bw,对照组和CTX组给予等体积玉米油,每天1次,连续14天。血液学指标检测:于实验第15天,摘眼球取抗凝血,进行红细胞、白细胞和血小板计数。瘤重及抑瘤率计算:实验结束后摘眼球取血处死小鼠,剥取完整瘤块称重,计算各组抑瘤率。脏器系数测定:取小鼠肝脏、脾脏和胸腺,称重,计算脏器系数。骨髓DNA含量测定:取小鼠一侧完整股骨,去除软组织,用10ml注射器抽取10ml0.005mol/L CaCl2将骨髓全部冲入离心管中,放置于4℃冰箱中静置30min,2500r/min 离心 15min,弃上清。向沉淀物中加入 0.2mol/L HC104 5ml充分混匀,90℃加热15min,冷却后3500 r/min离心10min,取上清,紫光分光光度计268nm下测定其OD值。研究结果1 DATS 90天经口染毒亚慢性毒性评价1.1 DATS对实验动物一般状态和体重的影响实验期间,各组动物活动正常,无异常行为和中毒症状,无死亡。与对照组相比,从第8周开始,雌、雄90mg/kg.bwDATS剂量组体重增长缓慢,而且雄性90mg/kg.bwDATS剂量组体重增加量与对照组相比有显著性差异(p0.05)。1.2 DATS对大鼠饲料摄入量和食物利用率的影响饲料摄入量结果显示,与对照组相比,雄性90mg/kg.bwDATS剂量组从第5周开始饲料摄入量显著减少(p0.05),且该剂量组总饲料摄入量显著性降低(p0.05)。1.3 DATS对大鼠血液学指标的影响与对照组相比,雄性30、60、90 mg/kg.bw DATS剂量组白细胞数显著性升高(p0.05),雌性30、90mg/kg.bw DATS剂量组白细胞数显著性提高(p0.05)。雄性90mg/kg.bwDATS剂量组血小板显著性升高(p0.05)。1.4 DATS对大鼠血清生化指标的影响与对照组相比,雄性90 mg/kg.bw DATS剂量组尿素氮显著性升高(p0.01)。雌性60、90mg/kg.bwDATS剂量组葡萄糖显著低于对照组(p0.05,p0.01),其中,90mg/kg.bw DATS剂量组总蛋白、球蛋白、总胆固醇升高(p0.05,p0.01)。1.5 DATS对大鼠脏器重量和脏/体系数的影响与对照组相比,脏器重量指标显示,雄性60mg/kg.bwDATS剂量组肝脏重量增加(p0.05),雄性60、90mg/kg.bw DATS剂量组脾脏重量显著性增加(p0.05,p0.01)。与对照组相比,脏/体系数指标显示,雌、雄90mg/kg.bwDATS剂量组肝脏系数显著性升高(p0.05,p0.01),雄性60、90mg/kg.bwDATS剂量组脾脏系数显著性升高(p0.05),雌性30、60、90mg/kg.bw DATS剂量组肾脏系数均显著性升高(p0.01,p0.05)。1.6 DATS对大鼠脏器病理形态的影响与对照组相比,雌、雄30、60、90mg/kg.bwDATS剂量组肝脏、胃肠道、睾丸或卵巢均无明显病理改变。雌、雄60、90mg/kg.bw DATS剂量组脾脏脾窦扩张,红髓淋巴细胞增生,血细胞增多,含铁血黄素颗粒沉着。雌、雄60mg/kg.bw DATS剂量组肾脏有轻微局灶性炎细胞浸润,肾小管变性,90mg/kg.bwDATS剂量组呈现管型,肾脏细胞变性坏死,局灶性肾小管间质炎细胞浸润。2 DATS抗肿瘤效果及其对CP化疗所致毒副反应的减毒增敏效果评价2.1 DATS对CTX化疗小鼠体重的影响与模型组相比,从第9天开始,25mg/kg.bwCTX组小鼠体重呈下降趋势,实验结束时,体重下降明显(p0.05),25、50mg/kgDATS干预组体重有所减轻,但与CTX组相比无统计学差异(p0.05)。2.2 DATS对CTX化疗荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响与模型组相比,25mg/kg.bwCTX组能显著抑制肿瘤的生长,其抑瘤率达69.8%(p0.01)。25mg/kg DATS+CTX 组、50mg/kg DATS+CTX 组抑瘤率分别达 67.9%(p0.01)和69.8%(p0.01),但与CTX组相比无明显差异(p0.05)。与模型组相比,50mg/kgDATS组抑瘤率达32.0%(p0.05),但与CTX组相比,其抑瘤效果存在明显差异(p0.05)。2.3 DATS对CTX化疗荷瘤小鼠血液学指标的影响与模型组相比,25mg/kg.bw CTX组小鼠白细胞水平显著下调(p0.05),25mg/kg DATS+CTX组、50mg/kg DATS+CTX组白细胞水平有所升高,但与CTX组相比,白细胞水平升高不明显(p0.05)。CTX化疗对小鼠红细胞、血小板水平均无明显影响(p0.05)。2.4 DATS对CTXX化疗荷瘤小鼠脏器重量及脏器系数的影响与模型组相比,CTX化疗对小鼠肝脏、肾脏重量及其系数影响较小(p0.05)但CTX化疗能显著降低小鼠脾脏、胸腺重量及其脏器系数(p0.05)。与CTX组相比,25mg/kg DATS+CTX组、50mg/kg DATS+CTX组能显著升高化疗小鼠脾脏绝对重量和脾脏系数(p0.05),但对胸腺重量及胸腺系数影响不明显(p0.05)。2.5 DATS对CTX化疗荷瘤小鼠骨髓DNA含量的影响与模型相比,25mg/kg.bwCTX化疗能显著降低骨髓DNA含量(p0.05),DATS干预对骨髓DNA含量有多提升,但与CTX组相比,其升高水平不明显(p0.05)。结论1.90天亚慢性毒性试验表明,DATS可以有效升高白细胞水平,使脾脏重量显著性增加;DATS的基准剂量为87.12mg/kg。2.肿瘤化疗中,DATS单独使用有一定的抑瘤效果;联合环磷酰胺使用时不能提高环磷酰胺的抑瘤率。3.DATS能拮抗环磷酰胺化疗所致的脾脏减小,但对拮抗白细胞、胸腺减少和骨髓抑制效果不明显。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114
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本文编号：
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