2,4-二氯苯酚处理人肝细胞HL-7702转录组表达研究

发布时间：2018-11-22 20:18

【摘要】：氯酚类化合物作为一类持久性有机污染物,在医药、农药、工业生产和合成材料等多个行业广泛使用,不可避免会对生态环境造成难以估量的影响。氯酚类化合物在环境中分布较广,大气、水体及土壤中均有其踪影,而且它们通常难以降解,不仅危害到生态环境中各种动植物的正常生长和繁殖,甚至还可以通过食物链或直接接触,威胁人类健康。2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)是氯酚类化合物中十分重要的一类物质,主要用工农业生产中于2,4-二氯苯氧乙酸、药物硫双二氯酚以及除草醚的合成。因其在生产活动中的大量使用,难以避免会被释放到环境中,从而会对生物体产生危害作用,2,4-DCP已被我国和美国等众多国家列入了优先控制污染物的名单。基于Illumina/Solexa高通量测序平台的转录组测序和分析技术(RNA-seq)可以在任何物种间实现单核苷酸水平的整体转录情况检测,通过检测结果可以进行转录本结构的分析及基因表达水平的分析。同时,还可以通过RNA-seq发现未知转录本和稀有转录本,全面的提供转录组信息。相比与传统的基因芯片技术,RNA-seq并不需要预先针对已知序列设计探针,也不受有无参考序列的限制。通过使用RNA-seq对转录组的研究,可以从整体水平上揭示基因结构以及基因功能,发现疾病发生过程或特定生物学过程中的分子机制。现有对于2,4-DCP的研究,多集中于环境中2,4-DCP的降解。2,4-DCP毒性机理的研究多处于生理指标的测定,而结合转录组测序技术的2,4-DCP毒性研究尚未见报道。本研究通过建立2,4-DCP处理人肝细胞HL-7702的转录组数据库,将转录组数据进行序列比对、功能注释及通路分析。通过对比2,4-DCP处理组细胞和对照组(无2,4-DCP处理)细胞的转录组差异表达,筛选出与2,4-DCP毒性等相关的基因,从而系统探讨其毒性机制。本论文得到的研究结果如下：1.通过RNA-seq技术,本研究共得到原始数据7.77 GB,其中对照组和2,4-DCP处理组分别得到54711542和51353236条的高质量配对短序列,其中能够比对到参考序列上的总reads条数,空白组有45318071条,2,4-DCP处理组有42090330条。覆盖度为90%-100%的基因分别占总基因数的56%和55%。2.通过对两组细胞转录组测序的结果进行差异基因表达分析,共筛选出1 521个差异表达基因(FDR≤0.001 AND |log2Ratio|≥1),其中上调基因数为795个,下调基因数为726个。3.经过GO功能显著性富集分析和KEGG通路富集分析,这些差异表达的基因主要参与固醇类的合成、细胞代谢、组织发育和内质网应激等生物过程。4.采用实时定量PCR技术(RT-qPCR)对ATP8A1、ATP8B4、CYP1A1、 CYP1B1、CYP2E1、CYP4F12、UGT1A6、UGT1A7、DHCR7和DHCR24等10个受2,4-DCP影响显著的基因进行了深入研究,结果表明RT-qPCR法与转录组分析结果一致。这些基因参与细胞膜结构的维持(ATP8A1和ATP8B4)、介导2,4-DCP在细胞内的代谢(CYP1A1、CYP1B1、CYP2E1、CYP4F12、UGT1A6和UGT1A7)并调控固醇类物质的合成(DHCR7和DHCR24),在细胞受2,4-DCP处理后,表达明显改变,也证明转录组结果反映了细胞内基因的真实表达情况。通过以上研究,本文发现2,4-DCP处理细胞后,其发挥毒性作用的可能机制有以下三点：(1)通过改变膜的磷脂结构进而影响细胞膜结构的稳定性。(2)通过代谢产生更具毒性的代谢中间产物或终产物,影响细胞内的正常生理功能。(3)通过影响固醇类激素的合成发挥其内分泌干扰的作用。总之,本文通过转录组测序从差异基因表达、GO功能富集分析和Pathway分析等方面,结合RT-qPCR验证实验全面系统地阐明了在2,4-DCP的作用下人肝细胞HL-7702的转录本特点,为进一步深入研究2,4-DCP的分子毒性机制奠定了研究基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114;Q78

【相似文献】