邻苯二甲酸酯对小鼠神经干细胞和骨髓干细胞的毒性研究

发布时间：2018-12-09 17:13

【摘要】：塑化剂又称增塑剂,是一种添加到高分子聚合物中用以增加材料柔软性或是使材料液化的一类添加剂,其中应用最为广泛的塑化剂是邻苯二甲酸酯类。邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters, PAEs)又称为酞酸酯,是一类结构相似且使用广泛的化学物质,在塑料制品中含量很高,因为它不与所添加进的物质形成的化学键不紧密,故容易释放到水、土壤、空气等环境中。PAEs的生物相容性较高,易污染环境,对生物造成毒害作用,研究发现塑化剂对人和动物的机体产生致癌、致畸、致突变作用,还会对动物的生殖系统产生毒害,影响动物的生殖发育。邻苯二甲酸二丁酯(di-butyl phthalate, DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate, DEP)和邻苯二甲酸二乙基己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)都属于邻苯二甲酸酯类中最常用的种类,有关其对人和动物在体外培养的细胞水平的影响研究非常少。本研究通过观察和检测不同浓度的邻苯二甲酸酯对昆明小白鼠神经干细胞和骨髓干细胞的影响,从细胞水平上揭示邻苯二甲酸酯对人和动物的影响,在干细胞水平上对邻苯二甲酸酯类增塑剂的毒性进行评估,为环境研究及医学研究提供参考。本研究取得的结果如下： 1、以怀孕第15-16天的胎鼠脑细胞为实验材料,进行原代培养,两代以上细胞传代后即培养分离形成的神经干细胞用于实验。将用于传代的神经球,机械法分离形成单个细胞,按1×105/mL在48孔培养板中培养,其中一组按不同浓度的DEHP (10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L)进行处理作为实验组,另一组的培养液中不加塑化剂作为对照组。对实验组和对照组的细胞增殖,凋亡及神经球的再形成能力进行观察和统计。并对两个组的过氧化氢酶(CAT)的活性进行检测。发现DEHP处理神经干细胞后,对神经干细胞的生长产生抑制作用,随着DEHP浓度升高和作用时间的延长,神经干细胞的增值和神经球的在形成能力与对照组相比差异很显著。主要表现在增值现象明显减少,神经球的形成不明显或形成后有明显的细胞死亡和退化现象。特别是在高浓度DEHP的作用下,细胞数明显减少,很少形成像对照组那样的正常神经球,且细胞很快退化并大量死亡,到96h时只剩下很少的细胞存在,相比而言,10-6mol/L实验组对神经细胞的影响较小,可以像对照组那样再形成神经球,但出现不同程度的细胞退化和死亡,细胞的增值能力明显减弱,所形成的神经球的体积变小。Giemsa染色后发现在DEHP作用下,实验组细胞的细胞核浓缩变小且随时间的延长细胞染色逐渐变浅。死亡细胞和胞体较暗的细胞越来越多,活细胞数目变小；检测加药培养48h时各组细胞中CAT活力,与对照组相比,DEHP实验组中CAT的活力均明显下降并呈现明显浓度依赖性。这说明DEHP对神经干细胞有明显的毒性作用。 2、用一月龄的小鼠骨髓为实验材料,进行原代培养,传代两次后即培养分离形成的骨髓干细胞用于实验。机械法分离形成单个细胞,按1×105/mL在48孔培养板中培养,加入不同浓度的DBP、DEHP和DEP(分别以10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L)对细胞进行培养处理,作为实验组。不加塑化剂的一组培养孔作为对照组。对对照组和实验组培养孔的细胞的增殖和凋亡等现象进行观察和统计。发现三种PAEs处理骨髓干细胞后,对骨髓干细胞的生长产生明显的抑制作用,随着PAEs的浓度升高和作用时间的延长,骨髓干细胞的增值能力与对照组相比差异很显著。主要表现在增值现象明显减少,细胞集落形成不明显或形成后有明显的细胞死亡和退化现象。特别是在高浓度PAEs的作用下,细胞数明显减少,很少形成像对照组那样的正常细胞增殖,且细胞很快退化并大量死亡,到96h时只剩下很少的细胞存在,相比而言,10'6mol/L的PAEs实验组对骨髓细胞的影响较小,但也出现了不同程度的细胞退化和死亡,细胞的增值能力明显减弱,所形成的细胞集落的体积明显变小,数量明显变少。随着PAEs浓度的增加和作用时间的延长,这些细胞边界模糊,折光率较差,胞体很小,胞质固缩,凋亡小体很明显。高浓度组中,处理时间达到一定程度时,骨髓干细胞胞核出现破裂,细胞开始崩解死亡。通过比较观察发现三种不同的PAEs处理,DBP的毒性最强,DEHP的毒性较强,而DEP的毒性相对较弱。三种PAEs都对骨髓干细胞都产生明显的损伤,细胞增殖受到明显影响,细胞凋亡现象严重,证明塑化剂对骨髓干细胞也有很显著的毒性作用。 3、本研究在细胞水平对邻苯二甲酸酯类塑化剂中的DBP(邻苯二甲酸二丁酯)、DEHP (邻苯二甲酸二乙基己酯)和DEP(邻苯二甲酸二乙酯)的毒性作用进行了较系统的研究,证明DBP、DEHP和DEP对神经干细胞及骨髓干细胞有很强的毒性作用,从细胞水平揭示了塑化剂的毒性作用表现,为环境研究和医学研究提供重要实验依据和理论参考,也为环保宣传及大众的环保意识的提高提供重要证据和警示,对人类健康及野生动物的保护具有重要的意义。
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【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114

【参考文献】