二甲基甲酰胺致H9c2心肌细胞凋亡内质网应激机制研究

发布时间：2018-12-15 07:29

【摘要】：目的初步探讨内质网应激是否参与二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)致H9c2心肌细胞凋亡过程,以及氧化应激是否介导该通路的激活。方法细胞培养至80%左右进行传代或染毒实验,CCK-8法检测24h不同浓度梯度下的细胞活力,计算DMF 24h IC50,最大染毒浓度设计依据IC50保证细胞活力大于70%。蛋白免疫印迹(western blotting,WB)检测不同浓度(DMF 24h,0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L)、不同时间(DMF150mmol/L,0h、4h、8h、24h)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)干预(24h,0 mmol/L、4mmol/L NAC 1h、150 mmol/L DMF、4mmol/L NAC1h+150 mmol/L DMF)条件下细胞总蛋白中质网应激相关蛋白GRP78、PIRE1α、Caspase-12、P-e IF2α、CHOP水平变化,其中最大染毒剂量设计依据DMF 24h半数抑制浓度IC50,时间和4mmol/L NAC预干预1h设计参考前期实验。TUNEL法检测NAC干预条件下细胞凋亡情况,免疫荧光细胞化学法(IFC)同步定位细胞内GRP78。结果CCK-8法检测结果显示DMF在0、50、100、125、150、175、200、225、250mmol/L不同剂量下染毒24h,DMF致H9c2心肌细胞凋亡24h IC50为176.378mmol/L。蛋白免疫印迹显示,DMF染毒24h(0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L),细胞GRP78、P-eif2α、P-IRE1α、Caspase-12、CHOP的蛋白水平组间差异具有统计学意义(GRP78,F=68.517,P0.001;Peif2α,F=38.932,P0.001;P-IRE1α,F=204.660,P0.001;Caspase-12,F=67.445,P0.001;CHOP,F=130.587,P0.001),随着染毒剂量的增加,五种应激蛋白水平均不同程度升高,除P-eif2α、CHOP蛋白水平在150 mmol/L最高,其余三种蛋白水平均在100 mmol/L时最大,且差异具有统计学意义(P0.05),说明细胞存在内质网应激。150 mmol/LDMF作用0、4、8、24h时,H9c2心肌细胞GRP78、P-eif2α、P-IRE1α、Caspase-12、CHOP的蛋白水平组间差异具有统计学意义(GRP78,F=92.902,P0.001;P-eif2α,F=3316.899,P0.001;P-IRE1α,F=161.780,P0.001;Caspase-12,F=57.485,P0.001;CHOP,F=97.513,P0.001)。伴随染毒时间的延长,五组蛋白水平均有不同程度上升,除Caspase-12蛋白是一直升高外,其他四组蛋白水平均在8h最高,与对照组比变化有统计学差异(P0.05),说明细胞存在内质网应激,与不同剂量组相比,都伴随有综合毒效应最大剂量和时间点。NAC干预后,细胞形态学观察150 mmol/L染毒24h后较染毒前,细胞回缩变圆、透亮,且部分漂浮在培养液中,染毒干预组较直接染毒组有所改善。TUNEL法检测NAC干预条件下24h的细胞凋亡,四组细胞凋亡率存在统计学差异(F=65.653,P0.001),与对照组相比,仅DMF组有统计学差异(P0.05),但NAC+DMF组与DMF组比较凋亡率降低,差异具有统计学意义(P0.05),说明NAC作用后氧化应激改善,细胞凋亡得到缓解。免疫印迹结果显示,NAC干预各组细胞总蛋白GRP78、P-IRE1α、Caspase-12、P-eif2α、CHOP水平变化组间差异具有统计学意义(GRP78,F=2688.457,P0.001;P-IRE1α,F=847.743,P0.001;Caspase-12,F=178.206,P0.001;P-eif2α,F=1931.161,P0.001;CHOP,F=42.001,P0.001),其中NAC组与对照组相比无统计学意义,说明NAC本身对H9c2心肌细胞无毒性作用,DMF组与NAC+DMF组比较,GRP78、Peif2α、P-IRE1α、CHOP四种蛋白水平均下降,差异均具有统计学意义(P0.05),说明内质网应激与氧化应激的改变有关。免疫荧光细胞化学法(IFC)结果显微镜下观察,对照组和NAC组细胞内核为蓝色较完整,少数细胞GRP78为红色荧光标记,集中分布在核的两端,DMF组可见部分细胞核出现碎裂,大部分细胞内GRP78呈斑点或云雾状弥散分布核周,NAC+DMF组细胞核较DMF组完整,可见部分弥散分布在核周的GRP78,且较DMF组已有所改善。结论内质网应激参与二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)致H9c2心肌细胞凋亡过程,氧化应激可能与内质网应激信号通路的激活有关。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114

【参考文献】