邻苯二甲酸单乙基己基酯对小鼠胚胎干细胞多能性维持的影响及机制研究

发布时间：2019-01-28 12:07

【摘要】：目的邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是工业上常用的塑化剂,广泛地存在于我们日常生活的各种商品中。PAEs会对机体的内分泌系统、心、肝、肺、肾及生殖系统等多种组织系统产生慢性毒性作用,存在一定的危险性。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是 PAEs 中使用最为广泛的一种化合物,而邻苯二甲酸单乙基己基酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)是DEHP在机体内的代谢活化产物,其毒性较DEHP更强。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESC)是一种能够无限增殖、自我更新、可分化为机体各种细胞的多能性细胞,因其对受试物有较好的灵敏性,是近年来常用的体外替代实验对象。为了探究MEHP的毒性作用,本研究就MEHP对小鼠胚胎干细胞的多能性维持的影响及其可能的机制进行研究,进而为胚胎早期发育的影响因素及相关机制的研究提供理论依据。方法1.细胞培养:用小鼠胚胎成纤维细胞(辐照后)(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)支持培养小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cell,mESC),于 37℃、5%CO2的培养箱中培养,隔天换液,5～7天可传代一次。用碱性磷酸酶染色法检测mESCs是否分化,被染成蓝紫色的mESCs表示细胞未出现分化,说明该批次细胞可用于后续实验。2.受试物的配制:称取MEHP溶于DMSO中,滤菌后,用mESCs培养液配制含0.1%DMSO的对照溶剂组及0.1、1、10、100、1000μmol/LMEHP的不同染毒剂量组。3.mESCs细胞形态观察:用含有不同浓度受试物的培养液培养细胞,在镜下观察MEHP对mESCs细胞形态的影响。4.细胞毒性检测:用含有不同浓度受试物的培养液培养细胞,将MEHP处理后的细胞进行细胞活力检测(CCK8法)和细胞凋亡检测(流式细胞术),分析MEHP对mESCs的细胞毒性。5.碱性酸酶活性检测:将MEHP处理后的细胞用碱性磷酸酶染色液进行染色,分析MEHP对mESCs多能性维持的影响。6.基因表达水平检测:将MEHP处理后的细胞,提取总RNA后,反转录生成cDNA,以Real-time PCR法检测多能性维持标记物SOX 2、OCT 4基因表达水平的变化。7.蛋白表达水平检测:将MEHP处理后的细胞分别用免疫荧光法和Western-blot法检测SOX 2、OCT 4蛋白表达水平的变化。结果1.细胞形态观察发现,随着染毒剂量的增加,mESCs的克隆细胞团的数量出现降低,细胞团的大小也有减少,在高剂量组(1OOOμmol/L)中效果尤为明显。2.细胞活力检测发现,高剂量组(1000μmol/L)的mESCs细胞活力显著降低(P0.05),其它剂量的细胞活力也出现降低趋势,但效果不显著。3.细胞凋亡检测发现,高剂量(1OO0μmol/L)MEHP可增加mESCs总细胞凋亡率(P0.05),其他剂量组随着染毒剂量的增加,凋亡率呈增加趋势,但与对照组比较效果并不显著(P0.05);而对于其他的细胞凋亡指标,如活细胞比率、早期细胞凋亡率、晚期细胞凋亡率、细胞碎片比率,各剂量组间均未出现显著性差异(P0.05)。4.碱性磷酸酶染色发现,对照组和低剂量组的mESCs均被染成深蓝色或蓝紫色,而高剂量(1000μmol/L)的mESCs着色较浅,甚至未着色。5.对mESCs全能性标记物SOX 2、OCT 4进行基因蛋白检测发现,在100μmol/L、100μmol/L剂量组中,SOX 2、OCT 4基因表达均出现显著降低(P0.05)。6.蛋白检测结果发现,SOX2、OCT4蛋白结果与基因结果相似,发现SOX 2和OCT 4蛋白表达在100μmol/L时其表达量出现降低,但不显著,而在1000μmol/L剂量时其表达量出现了显著降低(P0.05)。结论1.MEHP能够影响mESCs的形态,降低mESCs的细胞活力,并增加总的细胞凋亡率,因此,一定剂量的MEHP对mESCs存在细胞毒作用,能够抑制mESCs的正常生长。2.MEHP能够减少了碱性磷酸酶的合成降低mESCs多能性标记物SOX 2和OCT4的基因和蛋白表达水平,影响mESCs的多能性维持,致使其向着非正常的方向分化,进而影响到胚胎早期发育。
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【学位授予单位】：沈阳医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114

【参考文献】