过氧化苯甲酰对HepG2细胞DNA损伤作用及其可能的毒性机制研究

发布时间：2019-02-22 09:02

【摘要】：目的：过氧化苯甲酰（benzoyl peroxide,BPO）是我国自上世纪80年代以来普遍添加于面粉中的一种漂白剂，它具有增白面粉、加速面粉后熟、抑制面粉霉变、提高出粉率等作用。近年来，人们愈发关注它作为食品添加剂产生的安全隐患问题，使其应用备受争议。我国于2011年5月起禁止使用过氧化苯甲酰作为食品添加剂。而在世界范围内，仍有多个国家继续使用过氧化苯甲酰作为食品添加剂，且添加量参差。目前有研究表明外用BPO作为治疗痤疮的药物成分存在致癌可能，但摄入BPO具体对人类健康存在哪些影响及危害，仍无定论。因有报道BPO加热时可分解产生苯自由基，受此启发，拟探讨BPO产生的活性氧对HepG2细胞是否具有遗传毒性，并进一步研究其机制。我们选用的HepG2细胞是来源于人类的肝癌细胞系，它保留了人类正常肝实质细胞的许多功能，有较完整的生物转化代谢酶活性，被认为是检测外来化合物遗传毒性的理想细胞系。本实验研究选用HepG2细胞，检测BPO的遗传毒性及其氧化应激及溶酶体、线粒体途径的毒理学机制，旨在为摄入BPO引发的人类健康安全隐患提供试验及理论依据。方法：以HepG2细胞作为检测系统。用单细胞凝胶电泳（SGCE）来检测DNA链的断裂，用蛋白质印迹法（western blot）来检测损伤蛋白P53的生成。为了阐明BPO对HepG2细胞的遗传毒性机制，用2’,7’—二氢二氯荧光素（DCFH）来测定细胞内活性氧（ROS）水平，通过N-乙酰半胱氨酸（NAC）干预试验减少ROS生成来探讨氧化性损伤氧化应激在对DNA损伤中发挥的作用；分别以吖啶橙（AO）和罗丹明123（Rhodamine123）为探针来测定细胞内溶酶体膜稳定性和线粒体膜电位的改变水平，通过氯化铵（NH4Cl，溶酶体膜保护剂）、地昔帕明(desipramine，酸性神经鞘磷脂酶的抑制剂)进行干预来探讨溶酶体膜稳定性与DNA损伤的关系。此外，分别用NAC、NH4Cl和地西帕明干预单细胞凝胶电泳实验与蛋白质印迹实验，以更好的验证试验机制。试验结果用SPSS v11.5统计软件进行统计分析。结果：25-100μMBPO与HepG2细胞接触1h后，细胞内DNA链发生断裂，荧光显微镜下观察到细胞呈彗星样拖尾，其尾长和尾DNA含量随药物浓度增加而明显增加，呈剂量依赖效应，用NAC、NH4Cl、地西帕明进行干预后，尾长和尾DNA含量明显减少。25-100μMBPO与HepG2细胞接触24h后，检测到P53表达明显增多，呈剂量依赖效应，用NAC、氯化铵、地西帕明干预后，P53表达明显减少。25-100μMBPO作用于HepG2细胞1h后，引起细胞内ROS水平的增高，与对照组相比其差异具有统计学意义,用NAC干预后，ROS水平明显下降。25-100μMBPO与HepG2细胞接触1h后，溶酶体膜稳定性下降，呈剂量依赖效应，用NAC、氯化铵干预后，溶酶体膜稳定性得到一定保护。25-100μMBPO与HepG2细胞反应一小时，可使HepG2细胞线粒体膜电位下降，其差别具有统计学意义。结论：BPO(25-100μM)可以导致HepG2细胞DNA损伤，对HepG2细胞具有遗传毒性。同时，研究还表明BPO（25-100μM）可以导致HepG2细胞内ROS水平增高，，且用抗氧化剂NAC干预后ROS水平明显降低，同时DNA链断裂程度减弱，损伤蛋白P53表达减少，表明该DNA损伤可能与氧化应激有关。BPO(25-100μM)可导致HepG2细胞内溶酶体膜稳定性降低，氯化铵与地西帕明的干预使HepG2细胞溶酶体膜稳定性升高，且能减弱DNA链断裂的程度，减少P53的表达，表明BPO所致HepG2细胞遗传毒性也与溶酶体途径有关。BPO（25-100μM）同样可使HepG2细胞线粒体膜电位下降，一定程度上表明线粒体途径也是该遗传毒性的可能机制之一。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114

【参考文献】