骨髓间充质干细胞脑内移植对锰中毒大鼠治疗作用研究

发布时间：2019-03-08 20:08

【摘要】：【研究目的】1.探索最合适的锰中毒大鼠模型建立条件,并采用判别分析方法得到通用公式,筛选造模成功的大鼠为治疗对象;2.对造模成功的锰中毒大鼠进行脑内移植骨髓间充质干细胞,观察移植后细胞生长分化情况;3.通过检测多巴胺含量及路易小体相关成分的改变等观察骨髓间充质干细胞治疗效果。【研究方法】1.选用SPF级健康雄性SD大鼠24只,随机分为对照组、低剂量组(15mg/kg)、中剂量组(25mg/kg)和高剂量组(50mg/kg),腹腔注射MnCl_2·4H_2O,每48h/次,每隔一个月对所有大鼠进行行为学评分、肌张力改变、平衡木试验、水迷宫实验4项行为学测试,待大鼠出现明显行为改变时停止染毒,并检测其大脑纹状体酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)含量,探索最合适的造模条件(染毒剂量和时间),并以对照组大鼠TH平均水平的30%为界划分成锰中毒组和非锰中毒组,通过4项行为学指标联合建立判别分析函数,以便对下一步实验中的染毒大鼠进行判断。2.按上述方法的最合适造模条件对30只SD大鼠染锰,测试其行为学改变并记录各项行为学评分、肌张力评分等,按照造模时得出的判别公式,对每一只染毒大鼠进行判别。将所有符合锰中毒大鼠标准的大鼠挑选出来,随机分成空白对照组、骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cell,BMSCs)治疗组和PBS对照组,对BMSCs治疗组采用大脑立体定位法精准注射BMSCs,PBS对照组注射PBS,空白对照组不做任何处理。一月后测试大鼠行为学改变,并检测纹状体内多巴胺(dopamine,DA)含量,免疫荧光观察移植的干细胞生长、迁移和分化情况,western blot检测路易小体主要成分α-syn和NF-L的含量,透射电镜观察其超微结构改变。【研究结果】1.造模条件探索结果:高剂量组大鼠死亡一只,采用行为学评分、肌张力评分、平衡木测试及水迷宫实验多项行为学评分来评估23只染锰大鼠的行为学改变,综合测评大鼠的染毒效果。对照组大鼠三个月的各项行为学测试均为阴性,低剂量组行为学虽有改变但和对照组相比差异有统计学意义的较少,高剂量组和中剂量组出现行为改变的时间更短并且在染毒三个月的时间点上各项行为学改变差异均有统计学意义(P0.05)。根据TH的表达,高剂量组造模成功率为100%,中剂量组成功率为66.67%。由于高剂量组实验过程中出现动物死亡情况,综合评价得出采用25mg/kgBW浓度腹腔注射MnCl_2·4H_2O三个月为最佳造模条件。2.判别分析结果:将对照组大鼠TH表达平均值作为正常水平,TH表达若低于正常水平的30%则为锰中毒模型,由此将所有大鼠分为非锰中毒组和锰中毒。两组大鼠各项行为学评分结果,锰中毒组大鼠行为学评分均高于非锰中毒组,差异有统计学意义(P0.01)。以行为学指标全部作为自变量,以TH作为因变量纳入判别方程。Fisher判别法得到函数:锰中毒大鼠:Y=-31.830+8.867x1-4.995x2+9.862x3+0.952x4+8.877x5非锰中毒大鼠:Y=-22.831+2.792x1-3.318x2+7.043x3+0.874x4+8.241x5,其中x1-x5分别代表肌张力评分结果、平衡木评分结果、行为学评分结果、水迷宫逃避潜伏期、水迷宫平台搜索次数。将大鼠的各指标分别带入上述两组函数中求出判别函数值,哪个函数值更大,则该只大鼠即属于哪个组。符合率为为95.7%(22/23),误判率为4.3%(1/23);该判别函数对非锰中毒大鼠和锰中毒大鼠的正确判别符合率分别是92.3%(12/13)和100%(10/10)。3.骨髓间充质干细胞移植后行为学改变和理化指标观察:30只染锰大鼠中经过判别公式得出19只符合锰中毒标准,此次造模成功率为63.3%。移植手术后,大鼠生长情况良好,无感染或其他副反应出现,一周左右大鼠的头部皮肤完全愈合。治疗前后三组大鼠行为学评分、肌张力评分、平衡木试验差异均无统计学意义。治疗后三组大鼠纹状体内DA含量差异有统计学意义(F=5.376,P=0.016),BMSCs治疗组纹状体DA含量高于对照组(P0.01)。免疫荧光可见两组均有TH阳性细胞,但BMSCs治疗组TH阳性明显比PBS对照组多,说明两组都有DA神经元存在且BMSCs治疗组DA神经元比PBS对照组多。BMSCs治疗组可以看到聚集的H-Nuc表达,少数开始扩散,并随着脑脊液进入各脑室,说明外源BMSCs在大鼠大脑中可以存活至少一月,并能够迁移至其他区域。BMSCs治疗组有TH与H-Nuc双标阳性细胞,PBS对照组无双标阳性细胞。说明人源BMSCs移植入SD大鼠大脑后可成功分化为DA能神经元。PBS对照组同空白对照组差异不明显。Western blot显示BMSCs移植治疗后路易小体主要成分α-syn表达相比对照组减少而NF-L的含量增多。4.骨髓间充质干细胞移植后病理改变观察:电镜下,可以看到空白对照组的大鼠纹状体内较多神经元周围空泡、核周池扩张,核固缩、染色质聚集,胶质细胞出现染色质聚集现象。说明锰中毒大鼠纹状体神经元损伤和凋亡现象严重。神经元内还可见多处蛋白质聚集且部分蛋白质聚集物与溶酶体融合,髓鞘内可见神经丝异常。BMSCs治疗组可见较多纹状体神经元核膜呈圆形或椭圆形,具有完整的细胞结构。高线粒体、内质网、等细胞器丰富清晰,线粒体结构完整清晰,路易小体的蛋白质聚集现象较少,髓鞘内神经丝无聚集、线粒体形态正常。【研究结论】1.25mg/kgBW MnCl_2·4H_2O染毒三个月可建立较好的锰中毒模型,通过几项行为学测试组合得出的判别公式可筛选出锰中毒大鼠。2.BMSCs脑内移植损伤较小,移植的干细胞生长分化情况较好。3.BMSCs移植后DA含量增高,路易小体聚集减少,DA神经元损伤改善明显。
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【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R135.1

【参考文献】