Nedd4介导的乙烯菌核利生殖损伤跨代遗传机制研究

发布时间：2019-03-23 17:26

【摘要】：目的：乙烯菌核利(Vinclozolin, Vnz),是环境内分泌抗雄激素干扰物之一,在环境中广泛存在,常通过职业接触、食物表面残留和受污染的水体被人体摄入。Vnz常用作葡萄、果树、蔬菜等真菌病的防治。新疆维吾尔自治区是我国葡萄生产第一大省(区),Vnz在葡萄种植中高频使用,葡萄表面和葡萄酒中Vnz残留已是普遍现象,这对食品安全形成潜在风险。与传统抗雄激素药物氟他胺不同,在胚胎性别分化关健期暴露Vnz可引起F1-F3雄性子代出现雄性生殖系表观遗传跨代继承表型。因此,Vnz对人类、家畜、野生动物的生命和繁殖带来的广泛性、长期性潜在危害值得关注。目前,对源于胚胎期暴露Vnz引起的F1-F3子代表观遗传跨代继承表型分子机制尚不清楚。Vnz的表观遗传甲基化机制研究还不能完全解释跨代遗传继承表型现象。现提出多种假设学说,Nedd4介导的IGF-1R抗凋亡可能机制是其中的假设学说之一。Nedd4属泛素连接酶E3家族,Nedd4参与多种细胞过程和信号通路的调控。IGF-1R、雄激素受体AR、PTEN等是Nedd4的泛素化作用底物。Nedd4通过IGF-1R调控生长发育和细胞凋亡。Nedd4对AR的泛素化调节影响前列腺癌细胞的生长增殖。Nedd4是Vnz调控睾丸分化的侯选基因之一。Vnz通过干扰雄激素与AR的结合发挥作用。基于以上理论基础,有学者提出Nedd4介导的IGF-1R抗凋亡机制可能是源于胚胎期暴露Vnz引起子代表观遗传跨代继承表型的分子机制,目前这一机制未见实验研究报道。本文就Nedd4介导的Vnz生殖损伤跨代遗传机制和Vnz对生殖细胞损伤的体外实验为主要研究内容,以生殖损伤和生殖细胞凋亡为主要观察指标,通过现代多种生物学实验技术手段,深入探讨源于胚胎期暴露Vnz致子代生殖损伤的表观遗传跨代继承表型机制,以期全面了解Vnz的生殖毒性,并为Vnz的合理使用和科学防护提供理论参考。方法：本研究由动物体内实验和细胞培养体外实验两大部分组成：一、动物体内实验建立实验动物模型,选用SD孕大鼠,在E8-E14腹腔注射Vnz(100mg/kg/day),同时设立相应对照,F1子代分别在P20(出生后20天)、P60(出生后60天)采样,母鼠哺乳期结束后采样。1.一般指标测量：造模期间孕鼠体重增长情况；F1P20、P60子代肝、肾、睾丸、卵巢组织重量及脏器比；2.P60雄性子代精子数量及形态的变化；3.化学发光法检测P60雄性子代血清睾酮(T)含量和P60雌性子代血清雌二醇(E2),孕酮(P)含量；酶联免疫法(ELISA)检测P60子代血清卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)含量；4.形态学检测：常规HE染色病理切片进行P20、P60子代肝、肾、睾丸、卵巢组织形态学观察；原位末端标记技术(TUNEL)检测P20、P60睾丸和卵巢组织凋亡；5.免疫组织化学方法检测P20、P60子代睾丸和卵巢组织中Bcl-2、caspases3.caspases9蛋白的表达水平；6.Real-Time-PCR技术测定P20、P60子代睾丸和卵巢组织中Nedd4.Grb10、 IGF-1R;Bcl-2、caspases3.caspases9基因的表达水平。二、细胞培养体外实验1.建立大鼠卵巢颗粒细胞体外培养模型,研究Vnz对大鼠颗粒细胞的生长增殖、分化和类固醇激素分泌的影响；并通过Vnz培养颗粒细胞IGF-1R浓度的变化和雌二醇分泌影响机理的研究,探讨Vnz影响颗粒细胞类固醇激素分泌的可能机制。2.建立大鼠睾丸间质细胞体外培养模型,研究Vnz对大鼠间质细胞的生长增殖和睾酮分泌的影响；并通过Vnz培养间质细胞cAMP和IGF-1R浓度的变化探讨Vnz影响间质细胞分泌睾酮的可能机制。结果：一、动物体内实验结果1.Vnz暴露组孕鼠用药期间体重增长与对照比较无显著性差异(P0.05)；Vnz暴露组母鼠平均产子数、出生子鼠雌雄比例、出生体重及出生存活率与对照组比较无显著性差异(P0.05);Vnz暴露组P20、P60雄性子鼠体重、肝、肾脏重量及睾丸重量与对照组比较差异无显著性(P0.05);Vnz暴露组P20雌雄子鼠肝重、肾脏重量无显著性差异(P0.05)；P60子鼠雄性肝重、肾脏重量高于雌性(P0.05)；2.Vnz暴露组P60雄性子鼠精子数量减少(P0.05)；3.Vnz暴露组P60雌性子鼠血清雌二醇含量明显低于对照组(P0.05),孕酮含量低于对照组,但无显著性差异(P0.05); Vnz暴露组P60雄性子鼠血清睾酮含量明显降低(P0.05)；4.Vnz可致P20、P60子代肝脏组织脂肪变性,肝索排列不整齐；Vnz致睾丸组织生精小管管腔变大,生精细胞减少并伴水肿；Vnz致P20子代卵巢颗粒细胞层分布不匀,致P60子代卵母细胞边界不清,基膜增厚,卵母细胞透明带皱缩、放射冠边界不清,卵泡塌陷,出现卵泡闭锁；5.Vnz暴露组P20、P60子代睾丸和卵巢均发生明显凋亡(P0.05)；6.免疫组化结果：csapases3、caspases9在Vnz暴露组P20、P60子代睾丸和卵巢组织中表达增多(P0.05)；7. RT-PCR结果：实验组P20、P60雄性子代及P60雌性子代中Nedd4含量均低于相应对照组(P0.05); Grb10基因在各组中都是增高(P0.05); IGF-1R在各组中都是增高,但只有实验组P20、P60雄性子代中增高明显(P0.05); Bcl-2除了实验组P60雌性子代外,其他各组中均明显降低(P0.05)；实验组P60雄性子代中caspases3表达明显增高(P0.05)；实验组P60睾丸和卵巢组织中caspases9表达均增高(P0.05)。二、体外细胞培养实验结果1.Vnz作用颗粒细胞实验结果：Vnz高剂量(28uM)组培养颗粒细胞雌二醇的分泌量明显降低(P0.05)；与FSH组相比较FSH+28、FSH+14、FSH+7组雌二醇分泌量均降低(p0.05); FSH+28、FSH+14、FSH+7各组间比较无显著性差异(p0.05); E+28、E+14、E+7组雌二醇的分泌量略高于依西美坦单独作用时雌二醇的分泌量,但各组间无显著性差异(P0.05); Vnz培养颗粒细胞3β-HSD和P分泌量与对照组比较均无显著性差异(P0.05);Vnz培养颗粒细胞加入阻断剂后其雌二醇的分泌量与对照组比较差异有显著性(P0.05);Vnz培养颗粒细胞IGF-1R的表达与对照组比较明显降低(P0.05)。2.Vnz作用间质细胞实验结果：Vnz高剂量(28uM)组培养间质细胞睾酮分泌量明显降低(P0.05);Vnz高剂量(28uM)组培养间质细胞中cAMP浓度和IGF-1R浓度明显降低(P0.05)。结论：1.Vnz对孕鼠及子代体重增长没有影响；Vnz对平均产子数、出生子鼠雌雄比例、出生体重及出生存活率没有影响2.Vnz可致F1成年雄性子代精子数量下降,类固醇激素分泌改变3.Vnz可致F1子代肝脏脂肪变性、睾丸和卵巢组织损伤；4.Vnz对F1雄性子代和雌性子代的生殖细胞均有致凋亡作用；csapases3. caspases9可能介导了其凋亡过程；5.Vnz不影响颗粒细胞正常的增殖与分化；Vnz通过抑制卵巢颗粒细胞IGF-1R的表达,抑制了cAMP-PAK信号传导途径,进而抑制了颗粒细胞分泌E2。6.Vnz通过抑制睾丸间质细胞IGF-1R的表达,抑制了cAMP-PAK信号传导途径,进而抑制间质细胞分泌睾酮。在胚胎性分化关键期暴露Vnz的雄性子代中,Nedd4/Grb10复合体对IGF的泛素化降解使其生殖细胞IGF-1R的表达下调,从而降低了IGF-1R介导的PI3K/Akt和MAPK信号转导通路对caspases3.9促凋亡的抑制作用,从而促使凋亡增加。推测Nedd4/Grb10复合体对IGF的泛素化降解途径是胚胎期暴露Vnz导致F 1-F3雄性子代表观遗传跨代继承表型的发病机制。Vnz通过影响生殖细胞的IGF-1R表达,抑制了类固醇激素合成的cAMP-PAK信号传导途径,进而影响生殖细胞的分泌功能。
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【学位授予单位】：中央民族大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114

【参考文献】