CYP2A13在代谢活化AFB1及其所致BEAS-2B细胞恶性转化中的作用

发布时间：2019-04-26 16:58

【摘要】：黄曲霉毒素B1（AFB1）是黄曲霉和寄生曲霉产生的有毒代谢产物，在潮湿的环境中易于产生并污染食物，或存在于空气中。据估计，全球发展中国家有超过5亿人通过食物慢性暴露于黄曲霉毒素。早在1976年国际肿瘤研究机构就确认黄曲霉毒素类化合物可以致癌，并于2002年将AFB1定为Ⅰ类强致癌物。AFB1主要通过摄入被污染的食物和水引发肝脏毒性，但前期研究表明在收获、运输、储存和加工受黄曲霉毒素污染的农作物过程中，AFB1也可以存在于空气中并以细小微粒的形式经人的呼吸道吸入产生呼吸系统毒性。流行病学调查显示在吸入受AFB1污染的花生尘人群中，肝癌和肺癌的发生有显著增加。实验动物学证据显示AFB1也可以诱导肺和气道组织肿瘤。 AFB1并非直接致癌物，需要在体内经过代谢活化，其经过Ⅰ相代谢酶环氧化后可生成两种环氧化异构体，外环氧化物（exo-8,9-epoxide）和内环氧化物（endo-8,9-epoxide）。这两种异构体的活性和致癌性差异显著，其中exo-8,9-epoxide与DNA等大分子的亲和力比endo-8,9-epoxide起码大1000倍。exo-8,9-epoxide与DNA结合生成加合物可引发一系列遗传损伤。CYP1A2和CYP3A4是AFB1公认的优势代谢酶，主要表达于人肝脏，肺脏几乎不表达。前期研究表明在人呼吸道和肺脏中特异性高表达的CYP2A13也可以高效代谢活化AFB1，生成包括epoxides在内的多种活性代谢产物。但与CYP1A2和CYP3A4相比较，CYP2A13对AFB1的具体环氧化产物异构体种类不明确，且AFB1经CYP2A13的代谢活化与呼吸系统肿瘤发生的关系及其机制尚不清楚。通过异源表达获得纯CYP亚型酶是开展化学物体外代谢的主要手段，其中杆状病毒昆虫细胞（Baculovirus/sf9）表达系统可以高水平表达多种原始的CYP450蛋白，但此系统缺少CYP450酶合成所必需的血红素因子以及发挥催化作用时的电子供体POR蛋白，需要进行优化。采用重组代谢酶，体外重建代谢系统，模拟人体内环境，对外源化合物进行孵育，然后再采用先进大型仪器进行检测是目前体外代谢酶功能研究和药物筛选应用较广泛的方法。此外，人肺支气管上皮细胞（BEAS-2B）是来源于人支气管上皮组织的永生化细胞株，本身不表达AFB1代谢相关的CYP450酶类，但保持了较好的鳞状分化能力，是用来研究化学物诱导或影响细胞分化、致癌等效应的合适的细胞模型。综上所述，为了研究CYP2A13对AFB1的具体代谢产物种类和AFB1经CYP2A13代谢活化后引发呼吸系统肿瘤的具体分子机制：⑴在Baculovirus/sf9表达系统中加入不同的血红素，评价不同条件对CYP2A13和POR蛋白表达的影响，从而优化体外表达高活性CYP2A13的条件，同时尝试与CYP450酶的电子供体POR蛋白共表达，以获得高活性的CYP2A13蛋白；⑵利用优化的体外表达方法表达了AFB1代谢相关的CYP450蛋白，然后构建体外代谢体系，成功代谢AFB1，采用HPLC和HPLC-Q-TOF检测CYP2A13对AFB1的代谢活性以及环氧化代谢产物种类；⑶筛选了稳定表达CYP2A13的永生化人肺支气管上皮细胞（BEAS-2B）的单克隆株，用低水平AFB1连续处理40代，得到低水平AFB1致恶性转化细胞株，然后检测DNA损伤修复以及凋亡相关蛋白表达情况，以探讨低水平AFB1导致稳定表达CYP2A13的BEAS-2B细胞株恶性转化的机制。第一部分CYP2A13体外表达条件的优化在Baculovirus/sf9表达系统中加入5-ALA、hemin等血红素辅助因子可以成功表达有活性的CYP450s蛋白。但对于此类辅助因子的具体加入方式，种类以及浓度存在争议。此外，功能性CYP450蛋白的异源表达除了需要有完整的细胞、亚细胞结构、正确的蛋白糖基化、分泌、组织定位表达以及血红素等辅助因子参与外，其活性的发挥还需要细胞色素P450氧化还原酶（POR）、NADPH等辅酶为其提供电子。为了在Baculovirus/sf9系统中高效表达有活性的CYP2A13蛋白，我们首先构建了含CYP2A13和POR的cDNA的重组杆状病毒DNA；利用含CYP2A13基因或POR基因的杆状病毒感染sf9细胞，然后在培养液中加入不同浓度和不同组合的5-ALA、柠檬酸铁（Fe~(3+)）或hemin，分析了不同条件对CYP2A13和POR蛋白表达和活性的影响；最后我们尝试了在细胞培养液中同时加入含CYP2A13基因和POR基因的杆状病毒共同感染sf9细胞，对CYP2A13和POR蛋白进行共表达。结果显示，不同浓度和不同组合的血红素辅助因子可以影响CYP2A13和POR蛋白在Baculovirus/sf9系统中的表达。其中在培养液中分别加入0.2mM5-ALA、0.02mM Fe~(3+)或1μg/ml hemin得到的CYP2A13蛋白单独表达量最高，而联合加入0.2mM5-ALA和0.02mM Fe~(3+)时比单独加入得到的CYP2A13蛋白活性和表达量更高，且差异有显著性（P 0.01），同时该方法也可以得到活性最高的POR蛋白。不同的病毒比例对CYP2A13蛋白的表达有显著影响。其中当病毒比例为5:2（bvCYP2A13：bvPOR）时，CYP2A13蛋白的活性最高，跟其它组比差异有统计学意义（P 0.01）。因此，我们认为在Baculovirus/sf9系统中联合加入0.2mM5-ALA和0.02mMFe~(3+)，同时与POR蛋白以病毒比例为5:2（bvCYP2A13：bvPOR）共感染，最适合CYP2A13在该系统中的表达，可得到高表达量、有酶活性、天然不需修饰的CYP2A13蛋白。第二部分CYP2A13对AFB1的体外代谢活性研究建立体外模型研究代谢酶与特异性底物的关系，可排除体内因素干扰，直观酶对底物的选择代谢性，且能明确地检测代谢产物种类。体外重组高CYP450活性的代谢系统可以得到高产量的代谢产物，方便对代谢产物种类和生成量进行分析。虽然前期的体外代谢研究初步证实了CYP2A13可代谢AFB1生成包括AFB1-diol和AFM_1-diol（epoxide的水化合物形式）在内的数十种代谢产物，但许多代谢产物尚未完全明确。同时，跟AFB1的优势代谢酶CYP1A2和CYP3A4相比，CYP2A13对AFB1的代谢活力强度还不知道，且环氧化代谢产物生成量不明确。为了研究CYP2A13在体外代谢系统中对AFB1的代谢特征，我们首先利用第一部分建立的方法，在Baculovirus/sf9系统中对AFB1代谢相关的CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6和CYP2A13蛋白与POR蛋白进行了共表达；然后利用商品化的CYP1A2和CYP3A4蛋白代谢AFB1建立体外代谢孵育体系，同时建立AFB1及其产物AFM_1的HPLC前处理方法和检测方法；最后利用体外表达的各种蛋白代谢AFB1，并对其代谢清除率和环氧化代谢产物进行检测。结果显示，我们建立的体外代谢孵育系统可成功的代谢AFB1；通过三氟乙酸衍生化和HPLC-荧光检测器联用可较好的用于AFB1及其代谢产物的检测；我们体外表达的CYP1A2、CYP3A4和CYP2A13都可体外代谢清除AFB1，其中CYP2A13在60分钟内对5μM的AFB1清除率最高，达到了约80%；经HPLC-Q-TOF检测，CYP2A13可以代谢AFB1生成exo-8，9-epoxide。因此，我们认为CYP2A13对低剂量的AFB1清除率最高，甚至比公认的AFB1低浓度优势代谢酶CYP1A2更高，其活性代谢产物主要为AFB1exo-8，9-epoxide。第三部分AFB1对稳定表达CYP2A13的BEAS-2B细胞的恶性转化效应及其机制流行病学和实验动物学都证明吸入被AFB1污染的粉尘或食物摄入AFB1可导致呼吸系统肿瘤。在AFB1毒性发挥过程中，其代谢产物AFB1exo-8,9-epoxide（AFBO）与DNA分子共价结合形成AFB1-DNA，从而对DNA造成包括双链断裂在内的损伤。这种损伤在肝脏中主要通过激活癌基因Ras，抑制抑癌基因P53表达，促进细胞增殖、分化，从而诱发肝癌。但AFB1导致呼吸系统肿瘤的具体分子机制还不明确。为了研究AFB1导致呼吸系统肿瘤的具体分子机制，我们首先对稳定表达AFB1代谢相关CYP450酶的人肺支气管上皮细胞株（BEAS-2B）进行单克隆挑选，构建单克隆细胞株；然后选择对细胞无明显毒性的AFB1浓度对该细胞株进行持续处理，构建AFB1致稳定表达CYP2A13的BEAS-2B（B-2A13）细胞恶性转化模型；然后采用该恶性转化模型，对AFB1致细胞恶性转化过程中相关分子机制进行验证。结果表明，各单克隆细胞株CYP450酶蛋白表达水平较一致；经MTT法测定发现AFB1对稳定表达不同CYP450酶的细胞株毒性不同，其中以B-2A13的敏感性最强，甚至比B-1A2细胞更敏感。我们选用0.1nM、1nM和10nM AFB1连续处理细胞40代，经软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验验证，B-2A13细胞在0.1nM处理40代时就发生了恶性转化； Western blot结果显示，经AFB1持续处理，细胞的同源重组和非同源重组相关DNA损伤修复蛋白都呈现高表达；而促凋亡蛋白在处理早期高表达，随着细胞恶性转化表达量降低甚至失表达；此外Raf/MEK/ERK信号通路和PI3K/Akt信号通路中的Ras、Raf、ERK和Akt等关键蛋白都被激活。因此，我们认为低水平AFB1经过CYP2A13代谢后生成的AFB1exo-8,9-epoxide与B-2A13细胞的DNA结合生成加合物，这种加合物可累积并导致DNA双链断裂，从而激活和招募同源重组和非同源粘性末端连接重组通路相关蛋白进行修复；在处理早期，细胞对此类损伤不能修复，从而诱发细胞发生凋亡；但随着原癌基因Ras、Raf、ERK的激活，细胞的增殖和抗DNA损伤能力增强，同时激活了Raf/MEK/ERK信号通路和PI3K/Akt信号通路，使得细胞抗凋亡能力增强，，最终导致了细胞恶性转化。结论 1.在Baculovirus/sf9系统中联合加入0.2mM5-ALA和0.02mM Fe~(3+)，同时与POR蛋白以病毒比例为5:2（bvCYP2A13：bvPOR）共感染，最适合CYP2A13在该系统中的表达，可得到高表达量、有酶活性、天然不需修饰的CYP2A13蛋白。 2.采用体外CYP450酶异源表达系统可成功构建AFB1的体外代谢孵育系统，CYP2A13在体外代谢系统中可成功代谢AFB1，在5μM浓度时CYP2A13对AFB1的清除率比CYP1A2还要高，其活性代谢产物主要为AFB1exo-8，9-epoxide。 3.0.1nM的AFB1可导致B-2A13细胞恶性转化，并具有致瘤性。其机制可能与激活Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路，进而促进细胞增殖、增强抗凋亡能力等有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R114

【参考文献】