烟草烟雾冷凝物对人支气管上皮细胞Rap2B基因表达的影响

发布时间：2019-07-17 06:50

【摘要】：目的观察烟草烟雾冷凝物(cigarette smoke condensate, CSC)对人支气管上皮细胞(16HBE) Rap2B基因表达的影响及其启动子区甲基化水平的变化：1、观察CSC急性染毒后16HBE细胞的毒性特征及对Rap2B基因表达的影响,推测Rap2B基因在急性染毒阶段的作用,为后续研究提供实验依据。2、观察Rap2B基因在CSC致16HBE细胞恶性转化过程中的变化情况,探索Rap2B基因在肺癌的发生发展过程中的作用。3、观察CSC染毒16HBE细胞后全基因组甲基化水平及Rap2B基因启动子区甲基化的变化情况。 方法1、设置溶剂对照(DMSO)、CSC0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.12mg/ml、0.15mg/ml、0.18mg/ml、0.24mg/ml、0.30mg/ml9个剂量组,染毒24h后,采用CCK-8法测定终点,通过SPSS15.0软件计算IC50。16HBE细胞暴露不同剂量CSC (CTRL、DMSO、1/8IC50、1/4IC50、1/2IC50、1IC50)4h、8h、12h、16h、20h、24h,于倒置显微镜下观察细胞形态变化,荧光定量PCR检测Rap2B基因mRNA表达水平,Western Blot检测其蛋白表达水平。2、根据细胞毒性实验设置溶剂对照组和1/8IC50剂量组,重复染毒30代,每代细胞染毒24h,通过染色体畸变分析、软琼脂克隆形成实验及裸鼠成瘤实验鉴定16HBE细胞的恶性转化程度及检测mRNA和蛋白表达水平。3、以联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)的方法检测全基因组甲基化情况的变化；亚硫酸氢盐测序(bisulfite genomic sequencing, BGS)的方法检测Rap2B基因启动子区甲基化情况的变化。 结果1、CSC对16HBE细胞有毒性作用,通过软件计算CSC染毒16HBE细胞24h的半数抑制浓度(inhibitory concentration50%, IC50)为0.08±0.006mg/ml。设置对照组(CTRL)、DMSO组、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml6个实验组。16HBE细胞暴露CSC24h后,细胞形态发生一定改变,高剂量组细胞变为不规则形状；染毒20h及24h后,0.01mg/ml与0.02mg/ml剂量组Rap2B基因mRNA和蛋白表达水平上调,与DMSO组比较差异具有统计学意义(P0.05),随剂量组浓度增高,在0.08mg/ml组mRNA和蛋白表达下调至最低,与DMSO组比较有统计学意义(P0.05)。 2、随着染毒次数的增加,16HBE细胞染色体畸变率逐渐增加,P20与P30代细胞染色体畸变率分别为12%与18%,与对照组比较与统计学意义(P0.05)；软琼脂克隆形成实验发现P30代细胞的克隆数与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)；裸鼠肿瘤形成实验发现注射P30代细胞14d后可以发现肉眼可见肿瘤,至注射后28d的形成明显肿瘤组织；慢性过程中P30代细胞Rap2B基因mRNA表达水平与蛋白表达水平稳步增加,与DMSO组比较差异具有统计学意义(P0.05)。 3、慢性转化过程中各代细胞全基因组总体甲基化变化情况,ALU片段：P10(14.8%)、P20(12.8%)、P30(13.1%)与DMSO组(13.0%)比较差异没有统计学意义(P0.05)。LINE-1片段：P10(55.3%)P20(49.8%)、P30(49.3%)与DMSO组(53.4%)比较差异有统计学意义(P0.05),LINE-1甲基化率呈下降趋势；Rap2B基因启动子区表现出低甲基化。 结论1、Rap2B基因的表达在一定浓度范围内具有剂量效应关系和时间效应关系；随着染毒浓度的改变呈现先升高后下降的趋势,提示Rap2B基因可能作为CSC靶基因在其急性染毒过程中一定的作用。 2、CSC能够恶性转化16HBE细胞,具有一定的致癌作用。 3、Rap2B基因在16HBE细胞恶性转化过程中表达稳步上升,提示与肿瘤的发生具有一定的联系。 4、CSC慢性转化16HBE细胞过程中,全基因组甲基化率在一定程度上发生改变；Rap2B基因启动子区甲基化情况没有明显变化。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R114

【参考文献】

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本文编号：2515300