硫辛酸对氯化镉致L02细胞氧化损伤的抗氧化作用研究

发布时间：2019-07-20 16:06

【摘要】：镉(Cadmium,Cd)是一种广泛存在的重金属，在现代采矿、冶炼等工业活动中，容易成为环境污染物。镉由于其急性毒性作用和蓄积作用导致的慢性毒性作用，于1994年被国际癌症研究会(IARC)定为ⅠA级致癌物，即人类致癌物，美国毒物药理委员会(ATSDR)将其列为第6位危害人体健康的有毒物质。镉的急性毒性作用表现为对生物体的氧化损伤，且由于蓄积作用强、在人体内排出速度慢，生物半衰期达到10-30年，是已知的最容易在体内蓄积的毒物，常引发氧化损伤而最终导致肿瘤、衰老和生殖系统的损害。镉的DNA损伤作用与其直接损伤DNA和抑制DNA的修复有关。镉的常见无机化合物氯化镉(CdCl_2)的毒性作用表现为诱发活性氧的产生、引发脂质过氧化过程等。最新的研究表明，镉可以诱发多种细胞凋亡，特定的细胞株更是表现出明显的剂量效应关系。 α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，LA）化学名称为1，2-二硫戊环-3-戊酸（1，2-dithiolane-3-pentanoic acid），化学分子式为C_8H_(14)O_2S_2，分子量为206.33。硫辛酸在1951年由REED首次从猪肝脏中提取出来，研究者们自此开始了对硫辛酸的大量研究，逐步揭示出硫辛酸在清除ROS、螯合金属离子、再生抗氧化物质、修复氧化损伤等多方面抗氧化作用。Packer教授提出的“网络抗氧化”新理论显示，机体的抗氧化功能主要由Vc、Ve、CoQ_(10)、GSH和LA五种抗氧化剂完成，五种抗氧化剂并不是单一地发挥保护机体免受氧化损伤的作用，而是有机地构成一个完整的协作化的抗氧化防御的系统。其中硫辛酸还具有再生其它抗氧化剂的功能，成为网络抗氧化的核心。本研究从硫辛酸对氯化镉致L02细胞存活率的影响开始，以氯化镉作为氧化损伤毒物，以L02细胞作为靶细胞，从硫辛酸对L02细胞ROS、MDA水平的影响和DNA损伤修复等多方面着手，以期初步阐述硫辛酸的抗氧化剂作用。第一部分硫辛酸对氯化镉致L02细胞存活率的影响目的：探讨硫辛酸拮抗氯化镉所导致的L02细胞死亡的作用。方法：实验采用MTT实验（比色试验）测定细胞存活率。对培养过程中的L02细胞进行硫辛酸预处理6小时，并在氯化镉染毒过程中也加入硫辛酸对细胞进行实时保护，24小时后观察各组L02细胞的存活率。结果：与对照组相比，25μmol/L的氯化镉能够明显导致L02细胞死亡（存活率为55.81%，P＜0.05），10mg/ml的硫辛酸不会导致L02细胞死亡（存活率为103.61%，P＞0.05）；与镉单独作用组比较，低浓度硫辛酸不能拮抗氯化镉导致的L02细胞死亡（存活率为56.31%，P＞0.05），中、高浓度的硫辛酸可以拮抗氯化镉导致的L02细胞死亡（存活率为73.82%，109.25%，P＜0.05）；与对照组相比，高浓度的硫辛酸可以完全拮抗氯化镉导致的L02细胞死亡（存活率为109.25%， P＞0.05）。结论：硫辛酸可以拮抗氯化镉所导致的L02细胞死亡，使细胞存活率上升。第二部分硫辛酸对氯化镉诱发L02细胞ROS水平的影响目的：探讨硫辛酸对氯化镉诱发L02细胞ROS的清除作用。方法：利用DCFH-DA作为荧光探针，以氯化镉作为染毒物质，硫辛酸作为保护剂，L02细胞作为靶细胞，测定各组DCF荧光强度值的大小以判定ROS的水平。对培养过程中的L02细胞进行硫辛酸预处理6小时，并在氯化镉染毒过程中也加入硫辛酸对细胞进行实时保护，测定各组在染毒2小时内细胞内DCF荧光强度的大小（即ROS的表达水平）。结果：与对照组相比，25μmol/L的氯化镉能够明显诱发L02细胞产生ROS（DCF荧光强度值为1652，P＜0.05），10mg/ml的硫辛酸不会诱发L02细胞产生ROS（DCF荧光强度值为1149，P＞0.05）；与镉单独作用组比较，低中高浓度硫辛酸都能降低氯化镉诱发的ROS（DCF荧光强度值为1442，1162，822，P＜0.05）；与对照组相比，中浓度的硫辛酸可以降低氯化镉诱发的ROS至正常细胞水平（P＞0.05），高浓度的硫辛酸可以降低氯化镉诱发的ROS至正常细胞水平以下（P＜0.05）。结论：硫辛酸能够降低氯化镉诱发的L02细胞产生的ROS。第三部分硫辛酸对氯化镉致L02细胞氧化损伤产物MDA水平的影响目的：探讨硫辛酸对氯化镉致L02细胞氧化损伤的拮抗作用。方法：以氯化镉作为染毒物质，硫辛酸作为保护剂，L02细胞作为靶细胞，对培养过程中的L02细胞进行硫辛酸预处理6小时，并在氯化镉染毒过程中也加入硫辛酸对细胞进行实时保护，培养至24小时。先测定各组细胞总蛋白含量，再利用硫代巴比妥酸(TBA)法测定各组细胞经总蛋白含量标化的MDA含量。结果：与对照组相比，25μmol/L的氯化镉能够明显导致L02细胞氧化损伤，使MDA含量上升（MDA含量为14.05nmol/mgprot，P＜0.05），10mg/ml的硫辛酸不会导致L02细胞MDA含量上升（5.63nmol/mgprot，P＞0.05）；与镉单独作用组相比，低中高浓度的硫辛酸都能够降低氯化镉所致的L02细胞的氧化损伤，使细胞中MDA含量降低（MDA含量依次为11.11、8.29、5.92nmol/mgprot，P＜0.05）；与对照组相比，10mg/ml的硫辛酸能够完全保护L02细胞免受氯化镉所致的氧化损伤，使细胞MDA含量达到正常水平（P＞0.05）。结论：硫辛酸可以拮抗L02细胞免受氯化镉所致的氧化损伤，使细胞MDA含量下降。第四部分硫辛酸对氯化镉致L02细胞DNA损伤的影响目的：探讨硫辛酸对氯化镉致L02细胞DNA损伤的拮抗作用。方法：以氯化镉作为染毒物质，硫辛酸作为保护剂，L02细胞作为靶细胞，对培养过程中的L02细胞进行硫辛酸预处理6小时，并在氯化镉染毒过程中也加入硫辛酸对细胞进行实时保护，继续培养2小时。采用单细胞凝胶电泳技术（即彗星实验）测定细胞核在荧光下的Olive尾矩值，进而分析各组细胞的DNA损伤程度。结果：与对照组相比，25μmol/L的氯化镉能够明显导致L02细胞DNA损伤（Olive尾矩值为24.19，P＜0.05），10mg/ml的硫辛酸对L02细胞没有DNA损伤作用（Olive尾矩值为1.27，P＞0.05）；与镉单独作用组相比，低中高浓度的硫辛酸都能保护L02细胞免受氯化镉所导致的L02细胞DNA损伤（Olive尾矩值依次为18.09、10.62、5.17，P＜0.05）。结论：硫辛酸可以保护L02细胞免受氯化镉所致的DNA损伤
【图文】：
不同浓度氯化镉染毒条件下L02细胞的存活率

图 1 不同浓度氯化镉染毒条件下 L02 细胞的存活率2 不同浓度 LA 对氯化镉致 L02 细胞存活率降低的拮抗作用比对正常细胞，各组存活率依次为：氯化镉单独作用组（氯化镉 25μm55.81%、硫辛酸最高剂量组（硫辛酸 10mg/ml）103.61%、低浓度硫辛酸和镉联合作用组（氯化镉 25μmol/L+硫辛酸 0.1mg/ml）56.31%、中浓度硫辛酸化镉联合作用组（氯化镉 25μmol/L+硫辛酸 1mg/ml）73.82%、高浓度硫辛氯化镉联合作用组（氯化镉 25μmol/L+硫辛酸 10mg/ml）109.25%。经统计析，氯化镉单独作用组（氯化镉 25μmol/L）L02 细胞存活率与正常细胞组有统计学差异（P＜0.05），说明氯化镉在此浓度下能够明显导致细胞的死辛酸最高剂量组（硫辛酸 10mg/ml）L02 细胞存活率与正常细胞组相比，无学差异（P＞0.05），说明硫辛酸作为保护剂，并没有导致 L02 细胞存活率没有毒性作用，那么在联合组中 L02 细胞存活率的下降就可以认为由氯化致；低浓度硫辛酸和氯化镉联合作用组（氯化镉 25μmol/L+硫辛酸 0.1mg/m
不同浓度LA与氯化镉联合作用下L02细胞的存活率

图 2 不同浓度 LA 与氯化镉联合作用下 L02 细胞的存活率：与对照组相比，aP＜0.05，与镉单独作用组相比，bP＜0.05。讨论细胞存活率的检测有乳酸脱氢酶释放改良法、流式细胞仪法、同位素释放法TT 法等，MTT 法由于简单、经济、快速、无放射性污染等原因被广泛应用胞毒性试验、肿瘤放射敏感性测定以及生物活性因子的活性检测等。MTT 法又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMS溶解细胞中的甲瓒，，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，接反映活细胞数量。为了保证 MTT 测定结果的线性关系，一般要求吸光度 0-0.7 之间，吸光度值过高或过低时都对检验结果灵敏度有较大的影响，因
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114

【参考文献】