沙门氏菌属及其主要血清型的快速检测研究

发布时间：2019-08-08 20:13

【摘要】：本研究建立沙门氏菌及其主要血清型的环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）方法，，实现对沙门氏菌及其主要致病血清型的快速分型检测。通过序列同源性比较，确定沙门氏菌的属特异基因invE，及肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌三种血清型的血清型特异基因lygD、STM4495、fliC，并分别设计、合成特异LAMP扩增引物，均包括内引物对（FIP、BIP）和外引物对（F3、B3）。分别挑取沙门氏菌三种血清型纯培养单菌落，用煮沸法提取DNA模板。通过优化LAMP法操作中的各种条件，确定该法的最佳反应环境。分别选择肠炎、鼠伤寒、猪霍乱沙门氏菌标准株及几种非沙门氏菌菌株进行LAMP扩增，判断所设计的沙门氏菌属LAMP扩增引物和三种血清型引物的特异性。分别将纯培养2d的三种血清型菌株挑取单菌落，以生理盐水10倍梯度逐步稀释菌液，分别取各稀释菌液100μL进行平板计数，同时分别取各稀释菌液1mL提取DNA模板进行LAMP扩增检测LAMP法灵敏度，扩增产物分别采用凝胶电泳和直接在产物中加入SYBR-Green I染料两种方法检测。同时对提取的DNA模板进行PCR扩增，比较两种方法的灵敏度强弱。根据沙门氏菌各血清型的传播来源不同，分别选择不同的无菌食品样本人工添加目的菌种进行LAMP法扩增。结果显示采用沙门氏菌属特异性引物进行LAMP扩增，能特异的检出沙门氏菌三种血清型，而非沙门氏菌不能检出；分别采用三种血清型特异性引物进行扩增，三种血清型之间无交叉反应，且非沙门氏菌均不能检出，表明所设计的沙门氏菌属和血清型扩增引物特异性强。LAMP法针对invE基因细菌纯培养液检出限为2.0×10~1CFU/mL，PCR法检出限为2.33×10~3CFU/mL，而三种血清型细菌培养液LAMP法检出限分别为2.33×101CFU/mL、1.67×10~1CFU/mL、1.33×10~1CFU/mL，PCR法检出限分别为1.33×10~3CFU/mL、2.17×10~2CFU/mL、1.67×10~2CFU/mL，表明与PCR法相比，LAMP法的灵敏度高101~102倍。沙门氏菌属及三种血清型模拟样本检出限分别为1.67×10~1CFU/mL、2.67×10~1CFU/mL、2.0×10~1CFU/mL、2.0×10~1CFU/mL，基本与细菌纯培养液检出限一致，表明食品样本中潜在的干扰物质对LAMP反应体系影响不大。综上所述，LAMP法反应灵敏度高、特异性强，可用于食品中沙门氏菌及其主要血清型的快速检测。
【图文】：

引物,区段,步骤,模板

图 1-1 LAMP 引物位置示意图Fig．1-1 LAMP primer position schemes步骤（6）形成的哑铃型模板 F1 端向前延伸形成发卡状 DNA 1C 区段与该结构内的 F1 区段互补配对，继续引导 DNA 的取被置换出的单链片段中的 B1C 区段与 B1 区段互补配对，再次，分别形成更长的茎环结构（9）和哑铃型模板（12）。9）至（11）是茎环结构的 DNA 不断地进行扩增延长，最终物；步骤（12）至（15）与步骤（6）至（9）基本相同。

示意图,原理,示意图,反应体系

10图 1-2 LAMP 原理示意图[39]Fig．1-2 LAMP principle diagram一般实验流程包括：NCBI 的 GenBank 库中检索靶基因片段，并通过同源性分析软件确定该片段与其他物种基因的同源性不高，应用 LAMP 引物设计软件引物组，进行引物的合成、Bst DNA 聚合酶大片段及反应体系其他试剂的准备，反应体系，扩增反应，反应结果判定等[33]。
【学位授予单位】：武汉工业学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R446.5;R155.5

【参考文献】