耐热β-1，3-1，4-葡聚糖酶的构建及其酶学性质研究

发布时间：2019-08-19 13:06

【摘要】：β-1,3-1,4-葡聚糖酶(β-1,3-1,4-glucanase, E.C.3.2.1.73，简称β-葡聚糖酶)属于糖基水解酶类，降解β-葡聚糖中与β-1,3糖苷键相邻的β-1,4糖苷键。β-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于啤酒和饲料工业中。在啤酒生产过程中，大麦中的β-葡聚糖会降低麦芽汁和啤酒过滤速度，在啤酒贮存过程中容易引起沉淀等问题；在畜禽饲料中如含有较多的β-葡聚糖会增加食糜粘度，影响动物内源性消化酶与营养物质的接触，降低饲料的消化率。β-葡聚糖酶可有效避免β-葡聚糖在酿造和饲料工业中的上述不良影响，提高啤酒的质量和饲料的消化率。热稳定性差和催化活性低是当前β-葡聚糖酶在工业应用中普遍存在的问题。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)β-葡聚糖酶在酸性条件具有较高的酶活性，但其热稳定性较差；热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)是一种嗜热的厌氧菌，其所产生的β-葡聚糖酶的热稳定性高于芽孢杆菌所产生的β-葡聚糖酶，但酶活力较低。本研究以热纤梭菌β-葡聚糖酶和解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因为研究材料，采用基因重叠延伸技术(SOE)，将二者β-葡聚糖酶基因进行杂合和融合，构建耐热、高活性的β-葡聚糖酶。研究的主要结果如下： 1.构建了解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶。经摇瓶发酵培养，该酶的酶活性为80U mL~(-1)，纯化后酶的比活力为1106U mg~(-1)，最适反应温度和pH分别为50℃和6.0，在pH5.0-7.0范围内，具有较高的酶活性；以大麦葡聚糖为底物时，该酶的米氏常数(K_m)和催化效率常数(K_(cat)/K_m)分别为1.5mg mL~(-1)和369mL mg~(-1)s~(-1)；在80℃温度下处理30min，解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶仅有16%的残余酶活，具有较低的耐热性。 2.构建了热纤梭菌缺失锚定结构域β-葡聚糖酶。经摇瓶发酵培养，该酶的酶活性为7.8U mL~(-1)，纯化后的比活力为275U mg~(-1)，最适反应温度和pH分别为70℃和8.0，在pH7.0-9.0范围内，具有较高的酶活性；该酶的K_m和K_(cat)/K_m分别为2.7mg mL~(-1)和51mL mg~(-1)s~(-1)，在80℃温度下处理30min，有60%的残余酶活；与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶相比，热纤梭菌缺失锚定结构域β-葡聚糖酶的催化活性较低，但具有较高的热稳定性。 3.融合β-葡聚糖酶的构建。将热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端13个和27个氨基酸残基分别与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶N端融合，构建融合β-葡聚糖酶，分别命名为R13和R27。纯化后R13和R27的比活力分别为1074U mg~(-1)和1013U mg~(-1)，它们的最适反应温度和pH分别为60℃和6.0；在80℃温度下处理30min，R13和R27分别保留34%和52%的残余酶活，分别高出解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶残余酶活的18%和36%，但它们的耐热性均低于热纤梭菌β-葡聚糖酶。表明融合热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端13个和27个氨基酸残基，能够提高解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的耐热性。酶催化动力学研究表明，R13的K_m和K_(cat)/K_m分别为1.7mg mL~(-1)和324mL mg~(-1)s~(-1)，R27的K_m和K_(cat)/K_m分别为1.9mg mL~(-1)和288mL mg~(-1)s~(-1)。与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的催化活性相比较，R13和R27均有不同程度的降低，说明解淀粉芽孢杆菌N-端融合热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端13或27个氨基酸残基后，降低了解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶与底物的亲和力，进而影响了酶的催化活性，其中融合热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端27个氨基酸残基对解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶催化活性的抑制作用大于融合13个氨基酸残基的抑制作用。 4.双催化结构域β-葡聚糖酶的构建。将解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的催化结构域和热纤梭菌β-葡聚糖酶的催化结构域连接，构建双催化结构域β-葡聚糖酶。构建的双催化结构域β-葡聚糖酶命名为RQ，纯化后RQ的比活力为2434U mg~(-1)，RQ的最适反应温度和pH分别为70℃和6.0；耐热性研究表明，在80℃温度下处理30min，RQ有67%的残余酶活，分别高出R13和R27残余酶活的33%和15%，RQ的耐热性与热纤梭菌β-葡聚糖的耐热性相接近；RQ的K_m和K_(cat)/K_m分别为1.2mg mL~(-1)和1014mL mg~(-1)s~(-1)，其催化效率分别是R13和R27催化效率的3.13倍和3.52倍，也是解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶催化效率之和的2.41倍。以上结果表明：RQ的酶学性质并不是简单的解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶的酶学性质的叠加，而是赋予了新的酶学特性的β-葡聚糖酶，它除具有热纤梭菌β-葡聚糖酶的热稳定性外，其催化效率也高于解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶的催化效率之和。热纤梭菌β-葡聚糖酶的连接子可有效改善双催化结构域β-葡聚糖酶的耐热性和催化活性。 5.双催化结构域β-葡聚糖酶的耐热机理初步研究。将RQ中热纤梭菌β-葡聚糖酶的两个催化活性位点的谷氨酸(E134和E138)定点突变为丙氨酸(E134A和E138A)，构建含点突变的双催化结构域β-葡聚糖酶，并命名为RQM。耐热性研究表明，在80℃温度下处理30min，，RQM有57%的残余酶活，分别比解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶、R13和R27的耐热性提高了41%、23%和5%；与热纤梭菌β-葡聚糖酶和RQ的耐热性相比，RQM的耐热性分别降低了3%和10%。说明热纤梭菌β-葡聚糖酶不仅其N-端对RQ的耐热性有影响，而且其催化结构域的整个结构在稳定酶分子中发挥作用，包括其催化活性位点，热纤梭菌β-葡聚糖酶催化结构域和解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶催化结构域之间相互影响，产生协同效应，形成一种特性优良的、新的β-葡聚糖酶。 6.双催化结构域β-葡聚糖酶发酵培养基和培养条件如下：大麦粉43.48g L~(-1)、豆粉34.40g L~(-1)、NaCl2.40g L~(-1)、KH_2PO_42.40g L~(-1)和K_2HPO_412.50g L~(-1)；接种量1%(V/V)、装样量45mL/250mL、发酵培养基初始pH6.0-7.0、最佳诱导时期为在200rpm转速下培养3h后诱导。优化后的发酵培养基产β-葡聚糖酶的量为110U mL~(-1)，比初始发酵培养基提高了11%。虽然发酵产β-葡聚糖酶的量没有得到大幅度提高，但是优化后的发酵培养基中的碳源和氮源是廉价的大麦粉和豆粉，大大降低了β-葡聚糖酶的生产成本，具有很好的实际应用价值。
【图文】：

氨基酸序列,β-葡聚糖酶,β-葡聚糖,三级结构

简称 β-葡聚糖酶)是水解 β-葡聚糖中与 β-1,3 糖苷键相邻的 β-1,4 糖苷键的水解酶。β-葡聚糖酶水解 β-葡聚糖的主要产物是纤维三糖和纤维四糖 (如图1-1)[2]。不仅植物能够产生 β-葡聚糖酶，而且许多微生物 (细菌和真菌)也能够分泌 β-葡聚糖酶，用来降解它们周围环境中的多糖，为其生长提供能源。植物 β-葡聚糖酶属于糖基水解酶家族 17，它们的三级结构呈(a/β)8折叠桶状，而微生物 β-葡聚糖酶属于糖基水解酶家族 16，其酶的三级结构呈现果冻状 β-三明治结构[3]。虽然植物 β-葡聚糖酶和微生物 β-葡聚糖酶具有相同的底物专一性，但二者无论是在氨基酸序列上还是在三级结构上都不具有相似性。微生物 β-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于啤酒和饲料工业中。在啤酒生产过程中，大麦中内源性的 β-葡聚糖酶由于高温而失活

示意图,β-葡聚糖酶,三级结构,芽孢杆菌

图 1-2 浸麻芽孢杆菌的 β-葡聚糖酶的三级结构示意图1-2 The three dimensional structure of β-glucanases from Bacillus ma生化特性葡聚糖酶的分子量大约在 25-30 kDa 之间，它们的等电点为 7作用 pH 为 9.0，嗜碱芽孢杆菌在 pH 7.0-12 范围内仍保留大于 8酶的最适作用 pH 在 6.0-7.5 之间。不同芽孢杆菌的 β-葡聚糖酶的 (Bacillus polymyxa)[11]，55 ℃ (解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefa(浸麻芽孢杆菌 (Bacillus macerans)[12])，地衣芽孢杆菌 (Bacillus水解大麦 β-葡聚糖转化为还原糖葡萄糖的量计算，芽孢杆菌的 βl min-1mg-1之间，以大麦葡聚糖为底物时，芽孢杆菌 β-葡聚糖酶聚糖酶相比，非芽孢杆菌 β-葡聚糖酶往往带有其他不同功能的结杆菌 β-葡聚糖酶和芽孢杆菌 β-葡聚糖酶具有相似的生化特性。不子量和最适反应温度，如下表 1-1 所示。表 1-1 非芽胞杆菌的 β-葡聚糖酶的部分酶学性质Table 1-1 Enzyme characteristics of the non-Bacillus β-glucanase种类分子量（kDa）最适 pH 最适温度（℃纤梭菌m thermocellum)38 6.6-10 80 丝状杆菌er succinogenes)37 6.0 50
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R151

【参考文献】