三价砷甲基转移酶基因在UROtsa细胞系的转导及表达研究

发布时间：2019-09-06 06:58

【摘要】：目的构建人源三价砷甲基转移酶(AS3MT)的基因逆转录病毒表达载体,转导UROtsa细胞,建立稳定表达的细胞系。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),从人源HEK293细胞基因库中扩增出AS3MT基因,将AS3MT基因克隆到逆转录病毒表达载体pRetro X-IRES-Zs Green1中,经病毒包装后,转导UROtsa细胞,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,采用流式细胞仪筛选阳性克隆,半定量RT-PCR法检测AS3MT mRNA表达水平,免疫印迹法检测AS3MT蛋白表达水平。结果经RT-PCR扩增AS3MT基因、限制性双酶切及基因测序鉴定,证实AS3MT基因正确插入逆转录病毒表达载体。以该载体转染病毒包装细胞Retro Pack PT67后获得的病毒液滴度106cfu/m L。将病毒转导UROtsa细胞,转导效率达50.00%。经3次流式细胞分选仪筛选,获得成功转染并稳定表达GFP的URO-Retro X-AS3MT细胞株;半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果均表明所转导的AS3MT基因在UROtsa细胞中成功表达。结论成功构建能高水平稳定表达AS3MT基因的UROtsa细胞系,为研究AS3MT在砷的代谢、毒性和致癌性中的作用机制奠定基础。
【作者单位】： 广东省职业病防治院毒理实验所 广东省职业病防治重点实验室;华南农业大学材料与能源学院;Department
【基金】：美国NIH/NIEHS基金资助项目(R21ES022329,R01ES022629) 广东省职业病防治重点实验室(2012A061400007)
【分类号】：R114
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本文编号：2532460