大米主要过敏原RA17的重组表达及鉴定

发布时间：2019-11-02 02:21

【摘要】：背景： 随着转基因食品大量涌入中国市场，食物潜在的致敏性等安全问题越来越受到人们的关注。建立科学有效的食物过敏原性评价及检测方法成为科学家们研究的热点，而寻找一种低过敏原性的参照标准品是建立过敏原性评价及检测方法的关键问题之一。大米蛋白营养价值高，消费广泛，其过敏原性在所有谷物中是最低的，而且在中国，人们普遍食用大米，极少发生过敏现象，具有成为转基因食品过敏原性评价参照标准品的潜能。RA17（Rice allergen17）是大米主要过敏原之一，也是禾本科家族成员之间的交叉变应原的代表，因此，RA17是进行大米过敏原性评价的最佳参考品。 目的： 通过基因工程技术原核表达大米主要过敏原RA17蛋白，为大米过敏原性的评价、单克隆抗体的制备以及转基因食品过敏原性评价参照标准品的构建等后续研究提供实验材料。 方法： 1、人工手动对RA17基因序列进行密码子优化，并将优化的RA17基因由上海博尚生物技术有限公司进行全序列合成。 2、将RA17基因与含有strepⅡ标签的表达载体pET-44a连接后转入大肠杆菌Rosetta中进行重组表达，，并对其表达条件进行优化。 3、采用超声破碎法裂解菌体，获得包涵体，通过StrepTrapHP柱亲和层析纯化目的蛋白，并采用BCA蛋白定量和SDS-PAGE电泳技术对RA17重组蛋白的浓度和纯度进行分析。 4、采用蛋白免疫印迹技术和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法对RA17重组蛋白进行鉴定。 结果： 1、获得密码子优化的RA17基因序列并成功构建了表达载体pET-44a-RA17。 2、实验条件综合分析得出RA17重组表达菌株在30oC，IPTG诱导剂终浓度1.0mmol/L，持续表达3h，蛋白的表达量最高。 3、获得分子量大小约为16kDa，纯度达95%以上的RA17重组蛋白。 结论： 本研究首次在国内成功重组表达了分子量大小约为16kDa的大米主要过敏原RA17蛋白，为大米主要过敏原的过敏原性评价、单克隆抗体的制备以及构建转基因食品过敏原性评价参照标准品等后续研究提供了实验材料。
【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：S511;R151

【参考文献】

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本文编号：2554257