siRNA沉默HMGA2对人胚肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

发布时间：2017-03-22 06:07

本文关键词：siRNA沉默HMGA2对人胚肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

《华北理工大学》 2015年

siRNA沉默HMGA2对人胚肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

刘德方

【摘要】：目的运用RNA干扰技术,在人胚肺成纤维细胞(MRC-5)中将肺纤维化相关基因HMGA2沉默,取矽肺患者肺泡巨噬细胞的上清培养液刺激MRC-5,观察MRC-5细胞中I型和III型胶原的表达情况,探讨HMGA2在矽肺纤维化发生发展过程中的作用。方法1矽肺患者肺泡巨噬细胞(AM)的获取:对II期矽肺患者进行全麻下双肺灌洗获取肺泡灌洗液,经过滤、离心、PBS洗涤等过程,之后做HE、抗酸及瑞氏染色鉴定该细胞,置于10%FBS的DMEM培养基中继续体外培养。2 Si O2刺激肺泡巨噬细胞(AM)上清液的获取:在无血清培养基DMEM中加入Si O2后继续培养肺泡巨噬细胞。18h后收集培养上清液,过滤后冷冻保存。3干扰载体的构建:以p GPU6/GFP/Neo-sh GAPDH为载体,经上海吉玛公司构建HMGA2干扰载体及其对照载体。4 HMGA2干扰效率的检测:干扰载体经转染试剂LipofectamineTM2000介导分别转入人胚肺成纤维细胞MRC-5内,转染24h~48h后激光共聚焦显微镜观察转染效率。提取细胞总m RNA和总蛋白,经RT-PCR和Western-blot检测出最佳干扰效率的载体用于后续试验。5实验分为以下4组:空白对照组(C),含10%FBS的DMEM常规培养基培养人胚肺成纤维细胞MRC-5;刺激组(S),使用经Si O2粉尘刺激培养的AM上清液培养MRC-5;转染组(T),将筛选的最佳干扰质粒载体转染MRC-5后,再加入经Si O2粉尘刺激培养的AM培养上清液培养;阴性转染组(N),将阴性质粒转染MRC-5后,再加入经Si O2粉尘刺激培养的AM培养上清液培养。6 I型和III型胶原蛋白表达的检测:加Si O2刺激AM的培养上清液培养各组人胚肺成纤维细胞,在培养12h、24h、36h、48h和72h后,免疫细胞化学和Western-blot检测其中I、III型胶原蛋白的表达情况。结果1 Lipofectamine TM2000∶脂质体质粒=2μg∶3μl转染至人胚肺成纤维细胞MRC-5后24h~48h,激光共聚焦显微镜观察人胚肺成纤维细胞,结果显示90%以上细胞中有绿色荧光蛋白的表达。2用RT-PCR和Western blot法检测转染干扰载体后各组MRC-5细胞中HMGA2的表达,结果证实HMGA2的最佳干扰载体为p GPU6/GFP/Neo-HMGA2-homo-768;阴性转染组(N)与空白对照组(C)差异无统计学意义。3免疫细胞化学法和Western blot法检测结果均显示:空白对照组MRC-5细胞中有I型和III型胶原蛋白的表达;刺激组(S)与空白对照组(C)细胞相比,I型和III型胶原蛋白表达均有上调(P0.05);转染组(T)与阴性转染组(N)细胞相比,I型和III型胶原蛋白表达下调(P0.05);阴性转染组(N)与刺激组(S)相比,I型和III型胶原蛋白表达均无明显差异(P0.05),转染组与刺激组相比I型和III型胶原蛋白的表达也有下调(P0.05)。结论1经RNA干扰技术将人胚肺成纤维细胞MRC-5中HMGA2沉默后,其经AM上清液刺激而产生的I型和III型胶原蛋白表达受到明显抑制。2在人胚肺成纤维细胞MRC-5中下调HMGA2的表达可为矽肺的治疗提供理论依据。

【关键词】：
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R135.2
【目录】：

【参考文献】

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