壬基酚暴露激活大鼠子代海马小胶质细胞及小胶质细胞系类炎性反应的体内体外实验研究

发布时间：2020-04-11 03:56

【摘要】：目的:壬基酚(nonylphenol,NP)是一种常见的非离子表面活性剂,广泛应用于洗涤剂和化妆品等行业的生产,使用后经污水排入环境并大量蓄积。NP也是一种典型的内分泌干扰物(endocrine disrupting chemical,EDC),能模拟雌激素(estradiol,E2)与体内雌激素受体(estrogen receptor,ER)相结合,干扰机体稳定维持和调控作用。中枢神经系统(central nervous system,CNS)发育过程早期保护机制不够健全,且神经元受损后不易恢复,孕哺期胎儿及幼儿NP暴露正受到越来越多的关注。小胶质细胞(microglia,MG)是CNS中固有的免疫细胞,是CNS免疫的首道防线,它们极有可能成为NP的潜在靶点。在NP暴露所致MG激活过程中,我们选择与MG炎性激活密切相关的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路及ER蛋白深入研究,探讨其在壬基酚暴露激活大鼠子代海马小胶质细胞及小胶质细胞系类炎性反应中的可能作用机制。研究方法:本研究体内实验通过对怀孕0天至生产后21天母鼠以不同浓度壬基酚灌胃,构建孕期及哺乳期母体NP暴露仔鼠模型,取材分析生后第7及21天仔鼠。使用ELISA检测仔鼠海马中促炎症因子的含量,免疫荧光观察海马区MG,得出孕哺期壬基酚暴露将激活仔鼠海马MG并使其分泌过量促炎症因子。使用Western blot与免疫荧光检测Akt/MAPK/AP-1信号通路变化。体外实验通过建立BV2小胶质细胞系NP暴露模型,应用MTS检测BV2细胞对NP的耐受情况;使用光镜观察NP染毒后BV2细胞的变化;使用ELISA检测培养上清中促炎症因子的含量;使用Western blot与免疫荧光检测ER/Akt/MAPK信号通路变化;应用凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测AP-1蛋白与DNA结合活力。通过ER特异性拮抗剂预处理BV2细胞,ELISA检测ER拮抗后培养上清中促炎症因子的变化。结果:1.孕期及哺乳期NP暴露对孕哺期母鼠体重,存活率及怀孕天数的影响在GD14时,NP处理组(10,50和100mg/kg)体重分别为对照组母鼠体重的99.5%,96.1%及91.2%;在GD21时,NP处理组(10,50和100mg/kg)体重分别为对照组母鼠体重的98.2%,95.8%及89.9%。PND0-PND21各组母鼠并未死亡;对照组存活率为86.7%(13/15);10mg/kg处理组存活率为81.3%(13/16);50mg/kg处理组存活率为77.8%(14/18);100mg/kg处理组存活率为73.3%(11/15);母鼠死亡率随染毒剂量上升而上升,各组间无统计学差异。对照组与NP处理组(10,50和100mg/kg)母鼠怀孕天数分别为:21.92±0.49天,21.93±0.61天,22.13±0.52天,21.64±0.67天,各组间无统计学差异。2.孕期及哺乳期NP暴露对仔鼠体重及主要脏器的影响仔鼠于PND4记录分析其性别,各组间无统计学差异。PND7与PND21取材时称量仔鼠体重及主要脏器,脑组织(海马,皮质,小脑),甲状腺,性腺(睾丸或卵巢),肝脏,肾脏,脾脏质量,各组间均无统计学差异。对仔鼠主要脏器求其脏器系数(器官质量/体重×100%),脑组织(海马,皮质,小脑),甲状腺,性腺(睾丸或卵巢),肝脏,肾脏,脾脏质量,各组间均无统计学差异。3.孕期及哺乳期NP暴露导致仔鼠海马区促炎症因子分泌升高ELISA检测孕期及哺乳期NP暴露仔鼠海马的促炎症因子水平结果显示,10mg/kg处理组中,TNF-α水平在PND7和PND21时显著升高(P0.01);50mg/kg处理组中,TNF-α水平在PND7时显著升高(P0.01)。10mg/kg处理组中,IL-1β水平在PND7和PND21时显著升高(P0.01);50mg/kg处理组中,IL-1β水平在PND7时显著升高(P0.001)。IL-6水平在PND7时保持稳定,但在PND21时的10mg/kg处理组中达到峰值(P0.001),在50mg/kg处理组中仍是对照组的1.9倍(P0.01)。在PND7和PND21时,100mg/kg处理组中的TNF-α,IL-1β及IL-6水平与对照组没有差异。结果证实孕期及哺乳期NP暴露将导致仔鼠海马区促炎症因子分泌的增加。4.孕期及哺乳期NP暴露导致仔鼠海马区MG及Akt蛋白激活分析仔鼠海马区中分化抗原11b(cluster differentiation 11b,CD11b)免疫染色阳性细胞数,10mg/kg处理组,MG的数量在PND7和PND21时,显著增加到对照组的3.8倍(P0.01)与3.3倍(P0.01);50mg/kg处理组中,MG数量在PND7和PND21时,增加到对照组的3.5倍(P0.01)与2.4倍。孕期及哺乳期NP暴露将增加仔鼠海马中MG的数量。免疫荧光染色发现,10mg/kg处理组中,p-Akt染色强度在PND7和PND21时,与对照组相比显著上升;p-Akt表达的阳性位置与CD11b高度重合,提示仔鼠海马区MG在孕期及哺乳期NP暴露Akt的激活。Western blot结果显示,10mg/kg处理组中,p-Akt水平在PND7和PND21与对照组相比显著上升(P0.05),但总Akt水平在所有时间点及所有剂量组中保持稳定。5.孕期及哺乳期NP暴露对仔鼠海马区MAPK信号通路的激活Western bolt结果显示,在PND7时,p-p38在10mg/kg和50mg/kg处理组中开始上升,在100mg/kg处理组中,p-p38水平上升至对照组的2.2倍(P0.05);在PND21的10mg/kg和50mg/kg处理组中,p-p38水平分别上升至对照组的3.0倍(P0.01)和2.5倍(P0.05)。在PND7的10mg/kg处理组中,p-JNK水平显著上升(P0.05);在PND21的10mg/kg和50mg/kg处理组中,p-JNK水平分别上升至对照组的2.9倍(P0.001)和1.9倍(P0.05)。p-ERK水平,总ERK水平,总p38水平和总JNK水平,在PND7及PND21的所有剂量组中维持稳定。孕期及哺乳期NP暴露激活了仔鼠海马区MAPK信号通路中的p38与JNK。6.孕期及哺乳期NP暴露导致仔鼠海马区c-Jun蛋白激活Western bolt结果显示,c-Jun以及c-Fos水平在PND7及PND21的所有剂量组中保持稳定。磷酸化c-Jun(p-c-Jun)水平在PND7和PND21的10mg/kg处理组中,显著上升至对照组的1.6倍(P0.05)和1.4倍(P0.05)。孕期及哺乳期NP暴露导致仔鼠海马区AP-1活性水平升高。7.NP对BV2小胶质细胞活力的影响0.01-50μM的NP并未显著影响BV2细胞活力。但当NP浓度增加至80μM时,BV2细胞活力下降约30%并有显著差异(P0.001);当NP浓度增加至100μM时,BV2细胞活力仅为对照组的20%(P0.001)。8.NP对BV2小胶质细胞分泌促炎症因子的影响经30μM,50μM及70μM的NP处理后的BV2细胞的胞体增大,细胞凸起减少呈炎症激活态,激活程度随NP浓度增加而加重。经NP处理后BV2培养上清中,IL-6浓度在50μM的NP处理后显著升高达到最高(P0.01),70μM时有所降低,但仍是对照组的3.5倍(P0.01)。IL-1β浓度随NP浓度上升呈剂量-反应关系,在70μM达到最高值(P0.01)。与上面结果相反的是,TNF-α的分泌随NP浓度上升而逐渐降低,且各组间没有统计学差异。9.NP对BV2小胶质细胞中Akt的激活免疫荧光测定p-Akt水平,在30μM及50μM的NP处理后,p-Akt的水平升高,在70μM剂量组中,p-Akt水平恢复至正常。Western blot验证,30μM剂量组中,p-Akt水平上升至对照组的1.3倍(P0.05);50μM剂量组中,p-Akt水平显著上升至对照组的1.6倍(P0.001);70μM剂量组p-Akt水平恢复正常;总Akt水平在所有组中保持不变。10.NP对BV2小胶质细胞MAPK信号通路激活的影响Western blot结果显示,30μM处理后p-JNK的水平略有上升但无统计学差异;50μM及70μM的NP处理后,p-JNK的水平显著升高至对照组的1.5倍(P0.01)和1.8倍(P0.001)。30μM及50μM的NP处理没有改变p-p38的水平;70μM的NP处理升高p-p38的水平至对照组的1.3倍且有统计学差异(P0.05)。p-ERK的水平随着NP浓度的增加逐渐下降,并有统计学差异(P0.05)。11.NP对BV2小胶质细胞Akt/MAPK信号通路的时相特征选取各组中对NP浓度变化最明显的50μM剂量组做时效检测,发现在染毒后0.5-1h,p-Akt水平即达到最高峰(P0.001),随后缓慢下降至对照组的1.5倍并有统计学差异(P0.05)。p-JNK水平在0.5h迅速上升(P0.01),1h达到峰值(P0.01),之后缓慢下降,12h组与对照组相比仍显著升高(P0.05);p-p38水平在处理0.5h后迅速上升达到峰值(P0.001),之后一直下降,12h恢复正常水平;p-ERK水平在NP处理后一直下降,12h组的水平约是对照组的0.6倍,且有统计学差异(P0.05)。Akt/MAPK信号通路的0-12h时效结果与24h相一致。12.NP对BV2小胶质细胞AP-1蛋白DNA结合活力的影响应用EMSA对NP处理后BV2细胞中AP-1蛋白DNA结合活力检测。结果显示,30μM剂量组中AP-1的DNA结合活性即有增强;50μM剂量组AP-1结合活性最强,且有统计学差异(P0.001);70μM剂量组AP-1结合活性介于30μM与50μM之间。13.NP暴露对BV2细胞中ER水平的影响在BV2小胶质细胞细胞中,ERα未被检出,ERβ在BV2细胞中稳定表达。免疫荧光结果可见,ERβ主要在BV2细胞核中表达,并且,NP染毒剂量的上升,ERβ免疫荧光强度水平并无显著改变。Western blot结果验证,随着NP染毒剂量的上升,ERβ水平并无显著改变。14.ERβ拮抗剂对NP暴露后BV2细胞分泌IL-6水平的影响50μM的NP处理后,IL-6水平显著上升至对照组的5.3倍(P0.001);使用ERβ拮抗剂预处理BV2细胞,拮抗剂组IL-6水平显著下降至NP处理组的33%(P0.001);ERβ拮抗剂组IL-6水平与对照组相比无统计学差异。结果表明ERβ拮抗剂处理并不能引起IL-6的上升,但是能有效抑制NP引起的IL-6分泌。结论:1.孕期及哺乳期NP暴露导致子代海马MG的激活并使其分泌过量的促炎症因子。2.NP暴露所引起的子代海马促炎症因子的过量分泌可能由Akt/MAPK/AP-1通路所介导。3.NP暴露(中低浓度的暴露)就能导致BV2小胶质细胞炎性激活并使其分泌过量的促炎症因子。4.NP暴露所引起的BV2小胶质细胞促炎症因子的过量分泌可能由Akt/MAPK/AP-1通路所介导。5.NP暴露可能引起ERβ活性升高从而介导了BV2小胶质细胞促炎症因子的过量分泌。
【图文】：

动物,建模,仔鼠

2.2 孕期及哺乳期 NP 仔鼠暴露模型的建立孕期及哺乳期 NP 仔鼠暴露模型的建立：健康雌性 8 周龄 Wistar 大鼠(240-260g)80 只，从辽宁长生生物技术有限公司（本溪，中国）购得，国家实验动物使用许可证编号为 SYXK（辽）-2013-0007。所有的实验和外科手术都得到了中国医科大学动物使用伦理委员会的批准，该委员会符合卫生部关于实验动物使用指南。在所有实验进行当中，我们尽量减少动物的使用量以及它们的痛苦。雌性和雄性大鼠饲养在 24±1℃以 12h 昼夜周期的动物房中，能自由饮水以及摄取食物。在整个实验过程当中，大鼠饲喂以改良的 AIN-93G 饲料（图 2.2 B）以及去离子水。在适应实验室环境一周以后，雌性大鼠随机分配至对照及 NP 处理组中，并以雌雄比2:1 合笼，以第二天发现阴栓者记为怀孕（gestational day，GD）第 0 天。从 GD0到 GD21，用玉米油溶解 NP（10，50，100mg/（kg day））灌胃处理组母鼠，使用玉米油灌胃对照组母鼠(图 2.2 C)。在母鼠生产后（postnatal day，PND）第 4 天，将每窝仔鼠数减少到 8-9 只，，并且尽量保证雌雄数量相同。

对照组,仔鼠,处理组,单因素方差分析

在 50mg/kg 处理组中仍是对照组的 1.9 倍（P<0.01）（图3.2 C）。在 PND7 和 PND21 时，100mg/kg 处理组中的 TNF-α，IL-1β 及 IL-6 水平与对照组没有差异。综上所述，孕期及哺乳期 NP 暴露导致仔鼠海马区促炎症因子分泌的增加。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114

【参考文献】