微囊藻毒素-LR诱导小鼠肝铁含量增高对肝细胞凋亡的影响

发布时间：2020-04-23 08:27

【摘要】：目的本研究旨在探究微囊藻毒素-LR(MC-LR)对铁稳态的影响及调控机制,分析肝特异性microRNA-122(miR-122)在肝铁稳态失衡及肝细胞损伤中的作用,为MC-LR诱导铁稳态失衡及肝毒性提供新的分子机制和治疗靶点。方法分别选取8周龄的C57BL/6小鼠和Hfe-/-小鼠,将C57BL/6小鼠随机分成6组,雌雄各三组(10 ml/kg BW生理盐水、12.5μg/kg BW MC-LR和25μg/kg BW MC-LR)。将Hfe-/-小鼠随机分成四组,雌雄各两组(10 ml/kg BW生理盐水和25μg/kg BW MC-LR)。选取8周龄的C57BL/6小鼠,随机分成五组(10ml/kg BW生理盐水、12.5μg/kg BW MC-LR、25μg/kg BW MC-LR、agomir阴性对照组和25μg/kg BW MC-LR+miR-122 agomir),每天腹腔注射,注射两周。Agomir阴性对照组和25μg/kg BW MC-LR+miR-122 agomir组分别在每天注射生理盐水和25μg/kg BW MC-LR基础上每隔2天注射一次阴性对照agomir和miR-122 agomir,一共四次。血常规检测仪检测血常规指标;采用iron/TIBC Reagent Set kit检测血清中铁含量及未饱和铁结合力;普鲁士蓝染色检测小鼠肝组织铁含量。HE染色观察小鼠肝组织损伤情况;铀铅双染色观察细胞器损伤;TUNEL染色法检测肝细胞凋亡。Real time-PCR检测小鼠肝组织中铁稳态相关基因和肝细胞凋亡相关基因的相对表达量;Western blotting检测小鼠肝组织中铁稳态相关蛋白、凋亡相关蛋白、小肠中铁输出蛋白相对表达水平,免疫组织化学法检测小鼠肝组织肝细胞质中Cyt-c的释放情况。结果铁稳态指标检测结果显示,与对照组相比,RBC、HGB和HCV在两种小鼠体内均升高,MCV、MCH和MCHC均下降。肝铁和脾铁在C57BL/6小鼠中升高,但在Hfe-/-小鼠中却下降。普鲁士蓝检测的两种小鼠肝铁含量与用试剂盒检测的肝铁含量趋势一致。然而,肾脏铁在C57BL/6小鼠中是下降的,但在Hfe-/-小鼠中却是升高的。转染miR-122 agomir后小鼠肝铁蓄积现象得到改善。HE染色结果显示,对照组C57BL/6小鼠肝组织没有明显的损伤,但随着染毒剂量的升高,组织损伤情况逐渐加重。对照组Hfe-/-小鼠肝组织有轻微损伤,高剂量MC-LR染毒组损伤情况加剧,比C57BL/6小鼠高剂量染毒组严重。组织透射电镜结果显示,对照组Hfe-/-小鼠的心、肝、脾组织中细胞器均有不同程度的损伤,且在高剂量染毒组,心、肝、脾组织中细胞器的损伤程度远远高于对照组的损伤程度。与对照组相比,随着染毒剂量的升高,肝细胞凋亡逐渐增多。转染miR-122 agomir后,肝细胞凋亡与肝组织损伤均没有得到明显改善。基因检测结果显示,与对照组相比,随着MC-LR染毒剂量的增加,miR-122在C57BL/6小鼠肝组织中呈下降趋势,转染miR-122 agomir后miR-122表达显著升高。hepcidin、Bmp6、Il-6在这两种小鼠肝脏中均下降。在转染组小鼠中,hepcidin、HJV、Hfe、Bmp6、Il-6在小鼠肝组织中均下降,Tmprss6及Hif-1α均升高。转染miR-122 agomir后,hepcidin、HJV、Hfe、Bmp6、IL-6在小鼠肝组织中的表达均得到改善。同时,Tmprss6和Hif-1α的表达受到抑制。随着染毒剂量的升高,Bax的表达明显升高,Bcl-w、Bcl-2、caspase-3、caspase-8和caspase-9表达下降。转染miR-122 agomir后,Bax和Bcl-w的表达进一步下降,Bcl-2的表达升高,其他基因没有明显变化。蛋白结果显示,与对照组相比,FPN1表达上升,p-Smad1和p-Stat3在C57BL/6小鼠体内均下降,在Hfe-/-小鼠体内没有明显改变。在转染组小鼠中,与对照组相比,随着染毒剂量的升高,小鼠小肠蛋白FPN1的表达逐渐升高,小鼠肝脏蛋白p-Smad1/5/8、p-Stat3和Trf-1的表达均下降,转染miR-122 agomir后,FPN1、p-Smad1/5/8、p-Stat3和Trf-1的表达均升高。随着染毒剂量的升高,促凋亡蛋白Bax、caspase-3和caspase-8的表达逐渐增加,Bcl-2、Bcl-w和cleaved caspase-3表达下降,caspase-3和cleaved-caspase-9在低剂量组是下降的,在高剂量组caspase-3的表达升高,cleaved-caspase-9没有明显改变。转染miR-122agomir后,Bcl-w、Bcl-2、caspase-3和caspase-8的表达下降,cleaved-caspase-9的表达升高。随着染毒剂量的升高,Cyt-c在细胞质中的含量逐渐升高,转染miR-122 agomir后,Cyt-c的表达进一步升高。结论1.MC-LR可诱导小鼠肝铁蓄积,这可能是通过下调Hepcidin的表达导致的,而肝Hepcidin的下调与IL-6-STAT3和BMP-SMAD信号通路及肝组织中Tmprss6和Hif-1α的表达增加有关。2.MC-LR可以抑制肝特异miR-122的表达,过表达miR-122可改善MC-LR诱导的肝铁蓄积,这与IL-6-STAT3和BMP-SMAD信号通路及抑制肝组织中Tmprss6和Hif-1α的表达有关。3.MiR-122对MC-LR诱导的肝细胞凋亡及肝组织损伤没有挽救作用,这与miR-122对bcl-w的抑制有关。
【图文】：

18图 3.2 MC-LR 对肝铁含量的影响注：红色箭头指向的棕色位置代表含铁组织阳性位置。A、B 分别代表 C57BL/6 小鼠和Hfe-/-小鼠肝的普鲁士蓝染色。 a、b、c、d、e 分别代表对照、12.5μg/kg MC-LR、25μg/kgMC-LR、对照和 25μg/kg MC-LR 组。（a）、（b）分别代表 female 和 male。*代表与对照组相比， p<0.05，差异有统计学意义3.2 MC-LR 对小鼠体内铁稳态相关基因和蛋白的影响结果如图 3 A 所示，与对照组相比，随着染毒剂量的升高，在 C57BL/6 小鼠和 Hfe-/-小鼠肝组织中，Hepcidin1、Il-6 和 Bmp6 的表达均是下降的（p<0.05）。结果如图 3B 所示，随着染毒剂量的升高，FPN1 在 C57BL/6 小鼠和 Hfe-/-小鼠小肠组织中均是升高的趋势（p<0.05）。在调控 Hepcidin 的经典调控通路中，p-Smad1/5/8 和 p-Stat3 在 C57BL/6 小鼠肝组织中是下降的趋势（p<0.05），与hepcidin 的变化趋势一致，但在 Hfe-/-小鼠肝组织中的变化却不明显。p-Erk 在

图 3.3 MC-LR 对铁稳态相关基因和蛋白的影响注：横坐标代表检测的相关指标，纵坐标代表相对于对照组的相比比值。A、B、C、D分别代表 qPCR、蛋白定量、C57BL/6 小鼠和 Hfe-/-小鼠的蛋白条带结果。a、b、c、d 在 A、B 中分别代表雌性、雄性 C57BL/6 小鼠和雌雄、雄性 Hfe-/-小鼠。a、b 在 C、D 中分别代表小肠和肝脏的蛋白结果。*代表与对照组相比， p<0.05，差异有统计学意义3.3 MC-LR 对肝组织损伤及对心、肝、脾等组织细胞器超微结构的影响结果如图 4A 所示，在 C57BL/6 小鼠对照组的肝组织中，只观察到少量的肝细胞质疏松（黑色箭头），未观察到其他异常的改变，，但随着染毒剂量的升高，C57BL/6 小鼠肝组织的损伤情况是逐渐加重的，在 12.5 μg/kg MC-LR 组出现肝细胞坏死和核破裂（红色箭头），在 25 μg/kg MC-LR 组出现明显的病理改变，以胶原蛋白增生和肝细胞凋亡为特征。但在 Hfe-/-小鼠对照组中出现肝细胞轻微水肿、肝细胞肿胀、胞浆松染（黑色箭头），在 25 μg/kg MC-LR 组中，肝细胞水肿、肝细胞肿胀和胞浆松染更加显著（黑色箭头），并且在血管周围出现肝细
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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本文编号：2637541