邻苯二甲酸单乙基己基酯对HepG2细胞甘油三酯合成的影响

发布时间：2020-04-23 11:15

【摘要】：目的:以HepG2细胞作为研究对象,研究邻苯二甲酸单乙基己基酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)对HepG2细胞脂肪酸及甘油三酯合成的影响,从而探讨其导致肝脏脂肪变性的作用机制。方法:分别用不同浓度的MEHP(0.8、4、20、100μmol/L)以及0.05 mmol/L OA(阳性对照)染毒HepG2细胞24 h、48 h,用GPO-POD化学酶法检测HepG2细胞内以及细胞培养液上清中甘油三酯(TG)的含量;用不同浓度的MEHP(0、0.01、1、10、100μmol/L)以及1 mmol/L OA(阳性对照)处理HepG2细胞48 h,采用油红O染色法,观察细胞内脂滴蓄积情况。不同浓度MEHP(0、0.01、1、10、100μmol/L)及1 mmol/L OA(阳性对照)染毒HepG2细胞6 h、24 h、48 h,采用q RTPCR法检测细胞内固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1c)、碳水化合物反应元件结合蛋白1(Ch REBP1)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC1)、脂肪酸合酶(FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、长链脂酰辅酶A合成酶(ACSL5)、甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体亚型(GPAM)、1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶(AGPAT2)、磷脂酸磷酸酶(LIPIN2)、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)、P53肿瘤抑制蛋白(P53)、肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1A)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的m RNA表达水平;采用Western blot方法检测脂肪酸合成相关蛋白固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)、碳水化合物反应元件结合蛋白1(Ch REBP1)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC1)、脂肪酸合酶(FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)的表达情况。结果:1.通过油红O染色法观察到,MEHP染毒48 h,与阴性对照组相比,各染毒剂量组HepG2细胞内均有红色脂滴出现,且随着染毒剂量的升高,脂滴数量增多。2.经MEHP染毒24 h,与阴性对照组相比,HepG2细胞上清中TG含量无明显变化,而20、100μmol/L MEHP使细胞内TG含量明显增加。染毒48 h,100μmol/L MEHP使上清中的TG含量增加,20、100μmol/L MEHP使细胞内TG含量明显增加。3.与阴性对照组比较,染毒6 h,仅100μmol/L MEHP使SREBP-1c m RNA表达水平增加;染毒24 h,1～100μmol/L MEHP使SREBP-1c m RNA表达水平增加;染毒48 h,10μmol/L MEHP使SREBP-1c m RNA表达水平降低。与阴性对照组比较,染毒6 h,MEHP各剂量组均使Ch REBP1 m RNA表达水平升高;染毒24 h,1～100μmol/L MEHP使Ch REBP1 m RNA表达水平升高;染毒48 h,10、100μmol/L MEHP使HepG2细胞内Ch REBP1 m RNA表达水平降低。与阴性对照组相比,染毒6 h,MEHP各剂量组均使HepG2细胞内ACC1 m RNA表达水平升高;染毒24 h,MEHP各剂量组ACC1 m RNA表达水平未见明显差异;染毒48 h,100μmol/L MEHP使ACC1 m RNA表达水平明显降低。与阴性对照组相比,染毒6 h,1～100μmol/L MEHP使细胞内FASN m RNA表达水平升高;染毒24 h,MEHP各剂量组均使细胞内FASN m RNA表达水平降低;染毒48 h,仅100μmol/L MEHP使细胞内FASN m RNA表达水平降低。与阴性对照组相比,染毒6 h,MEHP各剂量组均使HepG2细胞内SCD m RNA表达水平升高;染毒24 h,10、100μmol/L MEHP使细胞内SCD m RNA表达水平降低;染毒48 h,100μmol/L MEHP组SCD m RNA表达水平明显降低。4.与阴性对照组比较,染毒6 h、24 h、48 h,10、100μmol/L MEHP均可使HepG2细胞内ACSL5 m RNA的表达水平明显增加。与阴性对照组比较,1～100μmol/L MEHP染毒6 h,100μmol/L MEHP染毒24 h以及10、100μmol/L MEHP染毒48 h均可使HepG2细胞内GPAM m RNA的表达水平升高。各浓度MEHP染毒6h、24 h、48 h,AGPAT2 m RNA的表达水平升高。染毒6 h、24 h、48 h,LIPIN2m RNA表达水平在10、100μmol/L MEHP组均升高。与阴性对照组相比,染毒6 h,10、100μmol/L MEHP使细胞内DGAT2 m RNA的表达水平升高,染毒24 h,仅有100μmol/L MEHP可使DGAT2 m RNA表达水平升高,染毒48 h,MEHP染毒各剂量组均可使DGAT2 m RNA的表达水平升高。5.与阴性对照组比较,染毒24 h、48 h,MEHP各剂量组SREBP-1c蛋白表达水平未出现明显差异。与阴性对照组比较,染毒24 h、48 h,10、100μmol/L MEHP组Ch REBP1蛋白表达水平明显增加。与阴性对照组相比,染毒24 h,1～100μmol/L MEHP使细胞内ACC1蛋白表达增加;染毒48 h,1～100μmol/L MEHP使细胞内ACC1蛋白表达降低。与阴性对照组相比,染毒24 h,1～100μmol/L MEHP使FASN蛋白表达增加;染毒48 h,100μmol/L MEHP使FASN蛋白表达降低。与阴性对照组相比,染毒24 h,仅100μmol/L MEHP使SCD蛋白表达水平增加;染毒48 h,0.01～100μmol/L MEHP均使SCD蛋白表达水平降低。6.与阴性对照组比较,染毒24 h,10、100μmol/L MEHP使细胞内P53 m RNA表达水平升高;染毒48 h,仅100μmol/L MEHP使HepG2细胞内P53 m RNA表达水平升高。与阴性对照组比较,染毒24 h,10、100μmol/L MEHP使细胞内PPARαm RNA表达水平降低;染毒48 h,1～100μmol/L MEHP使细胞内PPARαm RNA表达水平降低。与阴性对照组比较,染毒24 h、48 h,10、100μmol/L MEHP均使HepG2细胞内CPT1A m RNA表达水平降低。结论:1.高剂量的MEHP接触可导致HepG2细胞出现脂肪积累,造成脂质代谢异常。2.MEHP接触所引起的肝细胞脂质蓄积,可能与肝细胞内甘油三酯合成增加、脂肪酸β-氧化被抑制有关。
【图文】：

内脂,HepG2细胞,脂滴,油红

山西医科大学硕士学位论文2 结果2.1 通过油红 O 染色观察 MEHP 对 HepG2 细胞的影响由图 1 可见，1 mmol/L OA 组可见大量脂滴出现，且围绕着细胞膜内侧边缘呈环状分布，说明所建立 HepG2 细胞脂肪变性的模型是成功的，可作为阳性对照组。而阴性对照组的细胞结合紧密，边缘清晰且未见染色脂滴。与阴性对照组相比，MEHP（除 0.01 μmol/L 组外）各剂量组均可观察到大小不等的红色脂滴，且随着染毒剂量组的增加，，脂滴的数量也呈增加的趋势。

HepG2细胞,细胞内,相关蛋白,统计学意义

图 6 MEHP 对 HepG2 细胞内 SREBP1、 Ch注：与阴性对照组比较，*P<0.05; n=3.2.5.2 MEHP 对 HepG2 细胞脂肪酸合成相关蛋白如图7A所示，染毒24h，1 100μmol/LME染毒 48 h，1 100 μmol/L MEHP 使细胞内 ACC1（P<0.05）。如图7B所示，染毒24h，1 100μm蛋白表达增加；染毒 48 h， 100 μmol/LMEHP 和低，差异有统计学意义（P<0.05）。如图 7C 所示使 SCD 蛋白表达水平增加；染毒 48 h，0.01 100SCD 蛋白表达水平降低（P<0.05）。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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