基于肺组织芯片研究内质网应激在PM2.5诱导A549细胞凋亡中的作用

发布时间：2020-04-30 22:55

【摘要】：细颗粒物(Fine particulate matter,PM2.5)是空气动力学直径≤2.5μm的颗粒物,是大气污染物的主要成分。PM2.5易吸附空气中的重金属、微生物、有机物等有毒有害物质,通过呼吸系统进入人体,危害机体健康,但其损害作用及其机制仍未完全阐明。本研究利用PDMS材料,通过人非小细胞肺癌细胞(A549)和人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)共培养,两种细胞和聚碳酸酯膜共同模拟肺泡-毛细血管屏障在体内的关键结构特征和功能,构建了肺组织芯片,进行PM2.5的肺毒性分析。观察了PM2.5对A549细胞单独培养和肺组织芯片模式下凋亡的影响,并探讨了内质网应激和氧化损伤在凋亡发生发展中的作用,为揭示PM2.5对肺组织的损伤作用提供了科学依据。目的:1.建立肺组织芯片模型,探讨PM2.5的毒性作用。2.探究内质网应激途径在PM2.5导致的A549细胞凋亡中的作用。方法:1.PM2.5的采集及成分分析采用中流量空气颗粒物采样器进行采样,采用称重法测定PM2.5质量浓度、电感耦合等离子体质谱法测定重金属、气相色谱-质谱联用法测定多环芳烃、离子色谱法测定水溶性离子。2.单独培养模式下PM2.5对A549细胞凋亡的影响(1)建立细胞模型:设立对照组、10、20、50、100μg/mL PM2.5染毒组,染毒24小时。(2)利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验检测细胞存活率。(3)采用流式细胞仪通过异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)双染标记,检测细胞凋亡率。(4)利用活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、超氧化物岐化酶(Super Oxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)等生化试剂盒检测氧化损伤等指标。(5)Western-Blot检测内质网应激相关蛋白BIP、PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Caspase-3表达情况。3.肺组织芯片模式下PM2.5对A549细胞凋亡的影响(1)采用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)材料、聚碳酸酯膜制作肺组织芯片。(2)并利用液体交换、细胞形态观察、细胞凋亡率、ROS、炎症因子(IL-1α、IL-1β、IL-6和IFN-α)等指标对该模型的功能进行验证。(3)利用NAC进行干预,分为对照组、PM组、PM+NAC组,染毒24 h,通过ROS、细胞凋亡率、内质网应激相关蛋白表达情况探究内质网应激在PM2.5诱导A549细胞凋亡中的作用。结果:1.PM2.5成分分析研究期间PM2.5质量浓度范围264-487μg/m~3,平均质量浓度为413.83μg/m~3。12种金属和类金属元素中,Al的含量最高,其次是Pb、Mn和Cr;16种多环芳烃均有检出,其中茚并[1,2,3-c,d]芘的含量最高,其次是苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽和苊烯;4种无机水溶性离子中,含量最高的为SO_4~(2-),其次为NO_3~-和NH_4~+,含量最低的为Cl~-。2.单独培养模式下PM2.5对A549细胞凋亡的影响(1)随染毒浓度的增加,A549细胞存活率逐渐降低(P0.05),表明PM2.5抑制A549细胞存活并且存在剂量关系。(2)随染毒浓度的增加,A549细胞的凋亡率逐渐升高(P0.05)。表明PM2.5会诱导A549细胞凋亡。(3)随染毒浓度的增加,ROS水平、MDA含量逐渐升高(P0.05);SOD和GSH-Px活力随染毒浓度的增加而逐渐降低(P0.05)。表明PM2.5可以诱导A549细胞氧化损伤。(4)细胞内BIP、PERK、p-eIF2α、Caspase-3蛋白的表达量随着染毒浓度的增加而升高(P0.05),p-eIF2α蛋白与eIF2α蛋白比值逐渐升高(P0.05);PM2.5浓度为100μg/mL时A549细胞内eIF2α蛋白表达水平下降(P0.05);PM2.5浓度为20、50、100μg/mL时A549细胞内CHOP蛋白表达水平随染毒剂量的增加而升高(P0.05)。蛋白表达结果说明PM2.5导致了A549细胞内质网应激,PERK-eIF2α通路被激活,CHOP、Caspase-3凋亡蛋白表达量增加导致了A549细胞凋亡。3.肺组织芯片模式下PM2.5对A549细胞凋亡的影响(1)肺组织芯片模式下PM2.5对A549细胞的凋亡率高于单独培养模式,表明模型的成功建立且凋亡增高的原因至少部分是由活性氧和细胞间分泌的IL-1β和IL-6增高所造成的。(2)NAC干预后,PM组ROS水平显著高于对照组(P0.05),NAC组、PM+NAC组ROS水平与对照组见无明显差异,PM+NAC组ROS水平显著低于PM组(P0.05),说明NAC能降低ROS水平。(3)NAC干预后,PM组细胞总体凋亡率显著高于对照组(P0.05),PM+NAC组细胞总体凋亡率显著低于PM组且差异存在统计学意义(P0.05),说明NAC干预后会抑制A549细胞凋亡。(4)NAC干预后,PM组细胞BIP、PERK、p-eIF2α、Caspase-3蛋白表达量显著高于对照组(P0.05),PM+NAC组细胞BIP蛋白表达量显著低于PM组(P0.05);PM组细胞eIF2α蛋白表达量低于对照组(P0.05),PM+NAC组细胞eIF2α蛋白表达量高于PM组(P0.05);PM组和PM+NAC组细胞p-eIF2α蛋白与eIF2α蛋白比值高于对照组(P0.05),PM+NAC组细胞p-eIF2α蛋白与eIF2α蛋白比值显著低于PM组(P0.05);PM组和PM+NAC组细胞CHOP蛋白表达量均高于对照组(P0.05),PM+NAC组细胞CHOP蛋白表达量显著低于PM组(P0.05)。说明氧化应激是细胞出现内质网应激的条件,PM2.5可以通过内质网应激通路造成细胞凋亡。结论:1.成功建立肺组织芯片A549细胞与HUVEC细胞共培养模型。2.PM2.5可诱导A549细胞凋亡,且在肺组织芯片模式下更加明显,可能与细胞间分泌的炎症因子的互相影响有关。3.PM2.5可诱导A549细胞凋亡,且在肺组织芯片模式下更加明显,可能与氧化损伤导致的内质网应激途径有关。
【图文】：

示意图,研究假设,示意图

质网应激进而导致细胞凋亡[24]；六价铬会通过上调 BIP-PERK 通路蛋白致 A549 细胞经内质网应激途径发生凋亡[25]。针对内质网应激途径诱导549 细胞凋亡的机制研究认为，A549 细胞受到刺激后，内质网应激标志白 BIP 含量迅速升高，随后下游 PERK-eIF2α 通路蛋白表达上调，当有刺激未解除或持续增强时，促使细胞进入凋亡程序，CHOP、Caspase-3促细胞凋亡的蛋白表达量增多[26]。目前，PM2.5 是否会通过内质网应激径造成 A549 细胞凋亡目前并不清楚。本研究利用 PDMS 材料，通过 A549 细胞和人脐静脉血管内皮细胞HUVEC）共培养，两种细胞和聚碳酸酯膜共同模拟肺泡-毛细血管屏障体内的关键结构特征和功能，构建了肺组织芯片，进行 PM2.5 的肺毒分析。观察了 PM2.5 对 A549 细胞单独培养和肺组织芯片模式下凋亡的响，并探讨了内质网应激和氧化损伤在凋亡发生发展中的作用，，为揭示M2.5 对肺组织的损伤作用提供了科学依据。

示意图,掩膜,示意图,硅片

图 2 掩膜示意图.2 The sketch map of m先在浓硫酸中浸泡，以好的硅片，用去离子离子水冲洗干净后用分。在洁净的硅片上匀覆盖硅片表面，热图 3A 所示，调节甩胶rpm 保持 30 s。避光静片放在热板上避光烘min，缓慢冷却至室温紫外的石英玻璃板中和硅片放置在光刻机
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

【参考文献】