【摘要】：目的:邻苯二甲酸酯类(phthalates,PAEs)是一类被广泛作为增塑剂的环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs),其中邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)运用最广。现有研究表明DEHP污染日益严重,且具有广泛的雌性生殖毒性。卵巢是雌性生殖功能的核心器官,卵母细胞数目在出生前即已固定,若青春期前的原始卵泡受损,将直接影响雌性生育能力。课题组前期研究工作揭示,新生鼠DEHP暴露会显著抑制原始卵泡的形成,但其机制仍需深入探讨。自噬参与维持细胞内环境的稳定,前期研究发现DEHP暴露使自噬标志分子p62、ATG5表达显著增强,但在DEHP引起的卵泡发育异常过程中,自噬是否也发挥作用目前尚不清楚,值得关注。因此,本研究旨在探讨以下问题:(1)全面系统地了解DEHP在新生期和胚胎期暴露对卵巢原始卵泡发育的影响;(2)明确自噬紊乱是否参与了DEHP暴露所导致的原始卵泡发育异常这一过程;(3)探讨DEHP调控自噬,抑制卵巢发育的分子机制,为防控增塑剂污染和保障雌性生殖健康提供实验及科学依据。方法:1.动物模型建立及标本收集:将BALB/C鼠随机分为对照组、DEHP组、3-MA组、DEHP与3-MA联合暴露组、Compound C组、DEHP与Compound C联合暴露组。新生鼠连续腹腔注射5天,孕16.5天胎鼠卵巢体外培养6天后收集卵巢组织。2.探讨DEHP对原始卵泡发育的影响:HE染色及卵母细胞计数分析新生期/胚胎期小鼠卵巢各级卵泡发育情况。3.研究DEHP对自噬的影响:TME检测DEHP暴露后卵母细胞中自噬小体的存在情况,western-blot、qRT-PCR和免疫荧光检测自噬形成及降解过程中标志分子LC3、ATG5、Cathepsin B、Cathepsin L及LAMP2表达水平。4.探讨自噬在新生期/胚胎期DEHP暴露引起的原始卵泡早期发育异常中的作用:利用自噬抑制剂3-MA干扰自噬过程,研究在抑制自噬的情况下DEHP对新生期/胚胎期小鼠卵泡发育的影响,对卵巢各级卵母细胞进行计数,同时分析已被DEHP抑制的原始卵泡发育能否得到恢复。5.探讨DEHP调控自噬的信号通路:检测DEHP暴露后AMPK信号通路标志因子的表达水平,利用AMPK抑制剂Compound C阻断AMPK信号后,研究自噬关键蛋白的表达情况,并进一步分析原始卵泡发育情况。结果:1.新生期/胚胎期DEHP暴露抑制原始卵泡发育:体内外实验均发现,DEHP暴露使原始卵泡比例显著减少,合胞体比例增多。2.新生期/胚胎期DEHP暴露诱导自噬:TME检测发现DEHP暴露后的卵巢组织卵母细胞中存在明显的自噬小体,qRT-PCR及western-blot检测结果显示,自噬关键基因LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、Beclin1、Cathepsin L、Cathepsin B、LAMP2表达水平升高。LC3及LAMP2免疫荧光共定位结果显示,在DEHP组可观察到明显的LC3及LAMP2信号。3.DEHP通过诱导自噬,抑制原始卵泡发育:利用自噬抑制剂3-MA干扰自噬过程,进一步检测在抑制自噬的条件下DEHP对原始卵泡发育的影响。HE及统计结果显示,DEHP与3-MA联合暴露,原始卵泡比例得到一定程度的恢复,抑制自噬可以一定程度上逆转DEHP对原始卵泡的抑制作用。4.DEHP通过激活AMPK-SKP2-CARM1信号通路,从而诱导自噬,最终抑制原始卵泡发育:DEHP暴露使AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、FOXO3a、p-FOXO3a(S253)、TFEB和CARM1蛋白水平显著升高,而SKP2蛋白水平显著下降。这一结果提示,新生期/胚胎期DEHP暴露激活AMPK-SKP2-CARM1信号通路。利用AMPK抑制剂Compound C阻断AMPK信号通路后发现,DEHP上调的自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5和Beclin1水平被Compound C的联合暴露下调,且原始卵泡比例得到一定程度的恢复。结论:新生期/胚胎期DEHP暴露可通过激活AMPK-SKP2-CARM1信号诱导小鼠卵巢细胞自噬,从而抑制原始卵泡发育,损害卵巢功能。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114
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