【摘要】：目的采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术筛选与转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1活化成纤维细胞有关的差异蛋白,以期为研究矽肺纤维化的发病机制、防治策略提供新思路。方法贴壁法体外原代培养Wistar大鼠肺成纤维细胞,采用TGF-β1(5 ng/ml)诱导其活化,分为对照组、TGF-β1诱导组。采用iTRAQ技术标记蛋白样品,液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对标记的蛋白进行质谱分析,筛选对照组与TGF-β1诱导组中差异表达的蛋白。通过HOPE-MED8050动式染尘控制系统构建矽肺大鼠模型,分为对照24周组(control 24 w)、矽肺模型24周组(silicosis 24 w)。体外培养来源于对照24周组和矽肺模型24周组大鼠肺成纤维细胞。构建针对极低密度脂蛋白受体(Very low-density lipoprotein receptor,VLDLR)、多配体蛋白聚糖2(Syndecan-2,SDC2)的基因沉默载体并转染入人胚肺成纤维(MRC-5)细胞中,筛选有效沉默序列后分为:阴性对照组(Negative Control,NC)、VLDLR基因沉默组(VLDLRsiRNA#3)、SDC2基因沉默组(SDC2siRNA#3)、阴性对照+TGF-1诱导组(NC+TGF-β1)、VLDLR基因沉默+TGF-β1诱导组(VLDLRsiRNA#3+TGF-β1)、SDC2基因沉默+TGF-β1诱导组(SDC2siRNA#3+TGF-β1)。VG染色观察肺组织病理形态。免疫组织化学染色法检测V型胶原[Collagen alpha-1(V)chain,pro COL V]、XI型胶原[Collagen alpha-1(XI)chain,pro COL XI]、VLDLR、SDC2的表达与定位。免疫印迹法检测I型胶原(Collagen Type I,pro COL I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、pro COL V、pro COL XI、血管细胞粘附因子1(Vascular cell adhesion protein 1,VCAM1)、内质网跨膜蛋白214(Transmembrane protein 214,TM214)、VLDLR、SDC2的表达。结果1 iTRAQ技术共鉴定出1648个蛋白。与对照组相比较,TGF-β1诱导组有196个差异蛋白表达变化≥1.20倍,其中20个差异蛋白表达变化≥1.50倍(13个上调蛋白,7个下调蛋白)。生物信息学分析结果显示差异蛋白主要与细胞增殖、凋亡、炎症反应,以及信号转导通路等多方面功能有关。2 VG染色结果显示,对照24周组肺组织肺泡壁薄,结构清晰完整,且无胶原沉积,模型24周组肺组织可见肺泡壁明显增宽,并有较多的细胞性和纤维性矽结节形成以及红色胶原沉积。3免疫组织化学染色结果显示,与对照24周组相比较,矽肺模型24周组pro COL V、pro COL XI、VLDLR、SDC2阳性表达明显增强,多表达于矽结节以及间质纤维化区域。4 Western blot结果显示,矽肺模型24周组肺组织pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI、VCAM1、VLDLR和SDC2表达上调,分别为对照24周组11.09倍、27.17倍、7.03倍、3.61倍、12.16倍、2.39倍和21.12倍,而TM214无差异表达变化。在原代培养模型组24周矽肺大鼠成纤维细胞中pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI、VCAM1、VLDLR和SDC2表达明显上调,分别为对照24周组6.16倍、5.63倍、29.34倍、13.74倍、4.09倍、80.58倍和4.06倍,而TM214无差异表达变化。5细胞转染实验:(1)Western blot结果可见,转染VLDLR、SDC2沉默质粒序列于MRC-5细胞中发现,与NC组相比较,VLDLRsiRNA#3有明显沉默效果,VLDLR的表达降至NC组6.65%;同样,与NC组相比较,SDC2siRNA#3有明显沉默效果,SDC2的表达降至NC组21.14%。(2)Western blot结果显示,VLDLRsiRNA#3组pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI表达下调,分别降至NC组32.57%、42.55%、60.85%和16.65%;同样,SDC2siRNA#3组pro COL I、pro COL V、pro COL XI表达下调,分别降至NC组5.43%、19.41%和8.13%,而α-SMA无差异表达变化。(3)Western blot结果显示,在VLDLR转染实验中,与NC组相比较,NC+TGF-β1诱导组pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI表达上调,分别为NC组3.78倍、3.71倍、12.38倍和10.78倍,VLDLRsiRNA#3+TGF-β1诱导组pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI的表达明显下调,分别降至NC+TGF-β1诱导组的73.66%、55.70%、22.47%和50.06%;同样在SDC2转染实验中,NC+TGF-β1诱导组pro COL I、α-SMA、pro COL V、pro COL XI表达较NC组明显上调,SDC2siRNA#3+TGF-β1诱导组pro COL I、pro COL V、pro COL XI表达明显下调,分别降至NC+TGF-β1诱导组的44.95%、32.04%和37.63%,而α-SMA无差异表达变化。结论1 iTRAQ技术筛选出了196个与TGF-β1介导成纤维细胞活化有关的差异蛋白,其中pro COL V、pro COL XI、VCAM1、VLDLR和SDC2可能参与了矽肺纤维化的发生与发展。2基因沉默VLDLR、SDC2可在基础水平和TGF-β1诱导条件下抑制MRC-5细胞中胶原的合成。图14幅;表20个;参141篇。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R135.2
【图文】：
注：A：对照 24 周组（×12.5）；B：矽肺 24 周组（×12.5）；C：对照 24 周组（×400）；D：矽肺 24 周组（×400）图 1 矽肺大鼠肺组织的病理学改变（VG 染色）
华北理工大学硕士学位论文rn blot 结果显示（图 2、表 10）：pro COL I、α表达明显上调，分别为对照组 11.09 倍、27.17 倍在原代培养矽肺模型 24 周组大鼠的肺成纤维细显上调，与体内结果一致，分别为对照 24 周组具有统计学意义（P＜0.05）。proControl Silicosis
【参考文献】
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本文编号：
2736492
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