镍暴露工人外周血淋巴细胞亚群和血清细胞因子的改变及动物实验研究

发布时间：2020-07-07 02:20

【摘要】：目的:金属镍广泛应用于工业和人们日常生活中,是导致过敏性接触性皮炎最常见的过敏原。镍过敏一旦发生便可持续数年甚至终身,目前对于镍过敏的治疗均只能控制症状,无法降低对镍的过敏性,因此阐明镍过敏的发病机制,寻找镍过敏早期生物学效应指标,对镍过敏的早期诊断和治疗均具有重要意义。本研究首先以镍暴露工人为研究对象,探索镍暴露工人外周血淋巴细胞亚群和血清细胞因子的改变,寻找镍过敏早期生物学效应指标;同时通过构建镍致敏小鼠模型,检测镍致敏小鼠淋巴细胞增殖、活化功能的改变,为镍过敏的发病机制提供线索。方法:以整群抽样的方法,选择湖北省某电子厂70名镍作业工人为暴露组,同地区某食品厂126名工人为对照组,开展横断面分子流行病学研究。通过2.5%和5.0%硫酸镍斑贴实验将暴露组分为斑贴阴性组和斑贴阳性组。暴露工厂车间空气镍暴露水平经乙炔-空气火焰原子吸收光谱法检测;暴露工人皮肤镍浓度经电感耦合等离子体质谱法及外标法检测;尿镍浓度经分光光度计法检测。EDTA抗凝静脉血做血常规分析;外周血淋巴细胞亚群百分比采用流式细胞术检测,并结合血常规计算淋巴细胞亚群绝对值。流式液相多重蛋白定量技术检测血清细胞因子水平。动物实验以8周龄C57BL/6雌性小鼠为实验鼠,开展淋巴细胞增殖、活化功能及NK细胞杀伤功能的研究。通过上背部皮内注射联合背部封闭涂抹致敏、右耳和下背部激发的方式构建NiS04致敏小鼠模型,通过激发后48h双侧耳重量之差、激发后24h和48h耳肿、激发后48h激发部位皮肤变化与组织病理变化进行模型评价。激发后48h取样进行各指标检测。其中,脾淋巴细胞增殖的检测采用EDU渗入法,外周血淋巴细胞亚群分析、脾和淋巴结淋巴细胞活化的检测采用流式细胞术,脾NK细胞杀伤功能的检测采用CCK-8法和CFSE/Annectin-V/7-AAD流式三染法;同时取激发后48h脾单个淋巴细胞体外NiS04共培养24h,进行特异性淋巴细胞增殖和活化功能检测。所有数据通过SPSS Statistics 22.0软件进行分析。人群研究部分,年龄、BMI、外周血淋巴细胞亚群等指标符合正态分布,以x±s的形式表示;尿镍水平×100倍自然对数转换、血清MCP-1+3自然对数转换后呈正态分布,以P50(P25,P75)的形式表示,以转换后的形式用于差异性比较;该2类指标在对照组与暴露组间的差异性比较采用t检验;在对照组、低暴露组、高暴露组三组间和对照组、斑贴阴性组、斑贴阳性组三组间的比较采用单因素方差分析,三组间每两两组比较采用LSD-t检验,趋势性检验采用一般线性模型。血清IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α检出率均低于50%,该类指标检出率与吸烟、饮酒在对照组与暴露组两组间的差异性比较和在对照组、斑贴阴性组、斑贴阳性组三组间的差异性比较采用Pearsonχ2检验。血清IL-8、MIP-1β属于偏态分布计量资料,以P50(P25,P75)的形式表示;在对照组与暴露组间的差异性比较采用Mann-Whitney U检验;在对照组、低暴露组、高暴露组三组间和对照组、斑贴阴性组、斑贴阳性组三组间的比较以及三组间每两两组的比较采用Kruskal-WallisH检验。暴露组皮肤镍浓度×100倍自然对数转换、暴露工龄×100倍自然对数转换呈正态分布,以P50(P25,P75)的形式表示,以转换后的形式用于Pearson相关分析,原形式用于Spearman等级相关分析。其中,皮肤镍浓度与尿镍水平、总人群尿镍水平与外周血淋巴细胞亚群等指标、暴露组暴露工龄与外周血淋巴细胞亚群等指标的相关分析采用Pearson相关分析,总人群尿镍水平与血清细胞因子水平、暴露组暴露工龄与血清细胞因子水平的相关分析采用Spearman等级相关分析。动物实验研究部分,所有指标均以x±s的形式表示,对照鼠与镍致敏鼠两组间的差异性比较及不同浓度培养孔间的差异性比较均采用t检验。选用双侧统计学检验用于本研究统计学分析,检验水准取P0.05。结果:1、分子流行病学研究:镍暴露工厂车间空气中镍浓度范围为0.0054mg/m3～0.3757mg/m3,低于《车间空气中镍及其无机化合物卫生标准》(GB16210—1996)规定的可溶性镍化合物最高容许浓度0.5mg/m3;暴露组皮肤镍浓度为0.42(0.23,0.60)μg/cm2,尿镍水平为13.60(7.35,28.76)μg/L,两者呈正相关(r=0.332,P=0.012),同时,暴露组尿镍水平显著高于对照组6.02(3.93,10.97)μg/L(P0.001)。暴露组斑贴阳性工人共14人,斑贴阳性率20.00%(14/70),证明我国当前标准无法为高敏感个体提供足够保护。暴露组外周血白细胞、CD4+/CD8'、嗜中性粒细胞分别为7.03±1.67×1O9/L、1.68±0.72、4.54±1.45×109/L,显著高于对照组(6.23±1.35×109/L、1.27±0.43、3.7J±1.07× 1 09/L)(P0.05),CD8+T 细胞、NK 细胞和血小板分别为 0.52±0.26× 1 09/L、0.34±0.18×109/L、200.66±69.01×109/L,显著低于对照组(0.60±0.22×109/L、0.45±0.25× 1 09/L、229.85±51.48× 1 09/L)(P0.05)。暴露组血清 IL-4 检出率为 10.00%,显著低于对照组(51.61%)(P0.001):IL-8 水平为 6.70(5.61,9.61)pg/mL,显著低于对照组[10.45(4.62,40.90)pg/mL](P=0.001);MIP-1β 水平为 51.72(27.43,79.29)pg/mL,显著高于对照组[33.66(17.32,55.97)pg/mL](P=0.001),提示低浓度镍暴露可致作业工人血常规指标、淋巴细胞亚群及血清细胞因子发生改变。相关分析结果显示:全人群尿镍水平与外周血白细胞(r=0.244,P=0.001)、CD4+/CD8 +(r=0.177,P=0.015)、嗜中性粒细胞(r=0.285,P0.001)呈正相关,与血清IL-8(r=-0.150,P=0.040)呈负相关;按暴露组尿镍水平中位数(13.60μg/L)将暴露组分为低暴露组(尿镍≤13.60μg/L,n=35)和高暴露组(尿镍13.60μg/L,n=35)后,低暴露组白细胞、CD4+/CD8+、嗜中性粒细胞分别为6.89±1.89×109/L、1.64±0.68、4.35±1.51×109/L,高暴露组分别为 7.16±1.44×109/L、1.72±0.77、4.73±1.39×109/L,均显著高于对照组(6.23±1.35×109/L、1.27±0.43、3.71±1.07×109/L)(P0.05);血清 IL-8在低、高暴露组分别为 6.90(5.51,6.90)pg/mL 和 6.59(5.93,8.43)pg/mL,均显著低于对照组[10.45(4.62,40.90)pg/mL](P0.05)。提示外周血白细胞、CD4+/CD8+、嗜中性粒细胞和血清IL-8等4项指标对镍暴露更敏感。尚未发现外周血淋巴细胞和血清细胞因子与工龄的相关关系(P0.05)。镍暴露组中斑贴阳性组尿镍水平为13.66(7.71,30.04)μg/L,与斑贴阴性组[10.82(2.46,31.05)μg/L]差异无统计学意义(P=0.513);斑贴阳性组外周血淋巴细胞、T细胞分别为1.69±0.42×109/L、1.12±0.28×109/L,均同时显著低于斑贴阴性组(2.08±0.67×109/L、1.45±0.51×109/L)和对照组(2.10±0.51×109/L、1.41±0.38×109/L)(P0.05),血清 MCP-1 为 116.49(48.76,147.80)pg/mL,显著高于斑贴阴性组[57.03(37.43,85.85)pg/mL](P=0.002)和对照组[58.07(47.21,73.25)pg/mL](P=0.008),但斑贴阴性组和对照组该3项指标差异无统计学意义(P0.05),提示该3项指标可能作为筛选镍过敏的早期生物学效应指标。2、动物实验研究:镍致敏鼠激发后48h双侧耳重量之差、激发后24h和48h耳肿分别为5.00±3.81mg、0.05±0.04mm、0.06±0.03mm,均显著高于对照鼠(-0.17±1.47mg、0.00±0.01mm、0.01±0.01mm)(P0.05);镍致敏鼠激发后48h激发耳毛细血管充血、皮肤微红,背部激发处皮肤与对照鼠无明显差异;镜下可见镍致敏鼠激发耳及背部激发处皮肤炎性细胞浸润程度较对照鼠明显。提示镍致敏小鼠模型虽尚未出现肉眼可见的典型超敏反应皮炎,但对致敏原已产生了可检测的免疫应答反应,可认为迟发型超敏反应形成。镍致敏鼠外周血白细胞、B细胞分别为4.62±1.10×109/L、0.82±0.31×109/L,显著低于对照鼠(6.10±0.93×109/L、1.43±0.46× 109/L)(P0.05),结合镍致敏鼠激发部位皮肤组织出现的炎性细胞浸润,推测该结果可能由于镍致敏鼠外周血细胞向激发部位迁移所致;镍致敏鼠脾T细胞、CD8+T细胞增殖百分比分别为(1.51±±0.26)%、(0.59±0.11)%,显著高于对照鼠[(1.16±0.22)%、(0.42±0.11)%](P0.05),提示镍CD8+T细胞可能参与镍致过敏性接触性皮炎的形成;镍致敏鼠脾淋巴细胞CD69表达率为(0.80±0.24)%,显著低于对照鼠[(1.58±0.32)%](P=0.001),CD44 的表达率在两组间无明显差异,但镍致敏鼠淋巴结中淋巴细胞CD44表达率为(70.95±3.31)%,则显著高于对照鼠[(60.23±4.96)%](P=0.001),提示镍致敏鼠淋巴结部位的淋巴细胞发生活化;镍致敏鼠脾NK细胞对YAC-1细胞的杀伤率(%)与对照组相比,差异无统计学意义(P0.05)。镍致敏鼠与对照鼠脾淋巴细胞经NiSO4体外共培养24h,对照鼠15μg/mLNiSO4培养孔CD8+T细胞和NK细胞分别为2.00±0.89、2.00±1.67,显著低于0μg/mLNiSO4培养孔(4.33±0.58、5.67±1.53)(P0.05),提示 NiS04对 CD8+T 细胞和 NK 细胞存在毒效应,这与本研究第一部分发现镍暴露工人外周血CD8+T细胞和NK细胞下降一致;镍致敏鼠15μg/mLNiS04培养孔T细胞和CD4+T细胞增殖数分别为33.07±6.32、24.47±5.25,显著高于0μg/mLNiSO4培养孔(19.50±4.80、14.50±1.91)(P0.05),提示镍致敏鼠产生镍特异性T细胞和CD4+T细胞;而镍致敏鼠CD8+T细胞在15μg/mL NiSO4培养孔为9.50±3.62,虽高于对照孔4.91±2.49,但差异无统计学意义(P0.05),可能由于体外NiSO4共培养时,CD8+T细胞对镍的特异性免疫增殖效应无法完全掩盖镍的毒效应所致。结论:1、低浓度镍暴露可致作业工人出现血常规指标、外周血淋巴细胞亚群及血清细胞因子水平的改变,其中,白细胞、CD4+/CD8+、嗜中性粒细胞、IL-8等指标对镍暴露更为敏感;2、外周血淋巴细胞、T细胞,以及血清MCP-1可能作为筛选镍过敏人群的早期生物学效应指标;3、CD4+T细胞和CD8+T细胞均参与镍致ACD的形成,但镍对CD8+T细胞同时存在明显的毒效应。
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R135
【图文】：

物学效应指标；斑贴阴性组外周血ＣＤ４＋Ｔ细胞为０．８１±０．３０ｘｌ０９／Ｌ，显著高于斑贴阳逡逑性组（０．６３±０．２２ｘｌ0９／Ｌ）邋００．００４）和对照组（０．７０±０．２0ｘｌ0７Ｌ）邋（Ｐ＝０．０１４），而斑贴逡逑阳性组与对照组外周血ＣＤｆＴ细胞差异无显著性（Ｆ＞０．０５），见图１－４。逡逑ｒ—Ｐ＝０．００８逡逑？逦Ｐ＝０．００９逦５１逦１逦１逡逑５１逦｜逦：逦１逦尸＝０．０１３逡逑＾邋４－邋＾邋－邋１邋：＇逡逑ｘ逦４逦ｘ逡逑ｉ逦？：丨益：？奂逦，逦ｓ邋３＇逡逑Ｉ，邋Ｔ邋Ｔ邋＾邋ｆ，琴擎邋ｊ逡逑ｉ逦Ｈ逡逑0Ｊ逦．逦．逦１逦邋0Ｊ逦１逦１逦．逦逡逑刈Ｈｕｍ执粘RG对照ｍ谀粘削？川斑阽ｍｎｍ逡逑（ｎ＝１２６）邋（ｎ＊＊５６）邋（ｎ＝１４）逦（ｎ＝邋１２６）邋（ｎ＂＊５６）邋（ｎ＝邋１４）逡逑Ｐ＝０．００４逡逑Ｉ逦Ｉ逡逑Ｐ＝０．０１４逡逑２．０Ｉ逦Ｉ逡逑?逦＂逡逑ｘ逦１．５－逦１逡逑－逦▲逡逑｜邋１0＇暴：蠢逡逑ｐ邋０５－逦＾逦－Ｎ＊１逡逑°邋ｏ．ｏ逦．逦．逦，逦逡逑对照ｍ谀ＷＡｍ约丨斑咕ｗｍ：ｉｉＬ逡逑（ｎ＝邋１２６）邋＜ｎ＊？５６）逦（ｎ＝邋１４）逡逑图１－４对照组、斑贴阴性组、斑贴阳性组外周血淋巴细胞、Ｔ细胞、ＣＤ４；Ｔ细胞比较逡逑２．８斑贴阳性组与斑贴阴性组血清细胞因子的比较逡逑斑贴阳性组与斑贴阴性组血清细胞因子水平的比较发现，斑贴阳性组血清ＭＣＰ－１逡逑水平为丨邋１６．４９邋（４８．７６

３讨论逡逑职业性过敏性接触性皮炎（Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ邋ａｌｌｅｒｇｉｃ邋ｃｏｎｔａｃｔ邋ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＯＡＣＤ）为我逡逑国法定职业病，硫酸镍是引起ＯＡＣＤ常见的过敏原。我国《工作场所空气中镍及其逡逑化合物的测定方法（ＧＢＺ／Ｔ１６０．１６—２００４）》规定乙炔－空气火焰原子吸收光谱法为工逡逑作场所空气中镍及其化合物浓度的测定方法，当前《车间空气中镍及其无机化合物Ｒ逡逑生标准》（ＧＢ１６２１０—丨９％）曾规定（按Ｎｉ计）可溶性镍化合物最高容许浓度为逡逑０．５ｍｇ／ｍ３，金属镍及难溶性镍化合物为ｌｍｇ／ｍ３，该标准的提出屯要庙十镍的般山；逡逑性，不能保护感受性高的人员免受镍的致敏作用［５７］。国外大部分国家＃５８］规定车间逡逑空气中可溶性镍化合物的职业接触限值为０．１ｍｇ／ｍ３，远低于我国标准。德国技术参逡逑３１逡逑

EDU澄入法结合流式细胞术检测脾琳巴细胞增殖百分比;^:对段鼠脾淋巴细胞:B:镶致敏鼠脾淋巴细胞

【参考文献】

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本文编号：2744502