干预Nrf2通路对砷致家兔氧化应激影响的研究

发布时间：2020-09-03 11:01

　　目的:通过低、中、高不同剂量混合砷以及莱菔硫烷(SFP)和5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-DC)染毒新西兰大耳兔,研究Nrf2通路对砷致家兔氧化应激影响。方法:清洁级雌雄新西兰大耳兔80只,按体质量随机分为10组,分别为空白对照组、低剂量砷组(0.075mg·kg~(-1)·w~(-1))、中剂量砷组(0.15mg·kg~(-1)·w~(-1))、高剂量砷组(0.75mg·kg~(-1)·w~(-1))、低剂量砷+SFP组、中剂量砷+SFP组、高剂量砷+SFP组、低剂量砷+5-Aza-DC组、中剂量砷+5-Aza-DC组和高剂量砷+5-Aza-DC组。家兔自由饮水,持续染毒14w,取第9周中期家兔血和第14周末期皮肤进行试验。1.染砷14周后,取家兔同一背部皮肤样,电镜观察皮肤组织的形态学改变。2.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测家兔血清中谷胱甘肽(GSH)、血红素氧化酶(HO-1)、环氧化酶(COX-2)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、同型半胱氨酸(HCY)与家兔血清和皮肤中的N-6腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶(N6AMT1)的表达水平。3.用Quantitative Real-time PCR检测家兔血和皮肤中核因子E2相关因子2(Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、BTB-CNC异体同源体1(Bach1)、N-6-腺嘌呤DNA甲基转移酶1(N6AMT1)、亚砷酸甲基转移酶(As3MT)和多药耐药相关蛋白2(MRP2)mRNA表达水平。4.蛋白印迹法(Western blot)检测各组家兔血和皮肤Nrf2、Keap1、Bach1、As3MT和MRP2蛋白表达水平;结果:1.家兔皮肤电镜切片结果显示,砷能造成皮肤角化加重和基细胞层异常,加入SFP轻微改善了皮肤组织损伤,加入5-Aza-DC后角质层增厚。2.ELISA结果:血清中与对照组相比,低、中、高剂量砷组GSH表达明显降低,且N6AMT1表达升高(P均0.05),中、高剂量砷组HCY、COX-2和HO-1表达升高(P均0.05),高剂量砷组SAM表达升高(P=0.006)。皮肤组织中,与中剂量砷组比,中剂量砷+5-Aza-DC组的N6AMT1表达降低。3.基因水平:1)家兔血中,与对照组比较,低剂量砷组Nrf2、中和高剂量砷组Bach1、高剂量砷组As3MT、N6AMT1、MRP2 mRNA表达水平升高(P均0.05),低剂量砷组Keap1mRNA表达水平降低(P=0.036)。2)家兔皮肤中,与对照组比较,低剂量砷组Nrf2、中剂量砷组Bach1、中和高剂量砷组As3MT和N6AMT1 mRNA表达的水平明显升高(P均0.05)。与低剂量砷组相比,低剂量砷+5-Aza-DC组Nrf2 mRNA表达降低(P=0.005),Bach1 mRNA表达上升(P=0.017);与高剂量砷组相比,高剂量砷+SFP组的As3MT、N6AMT1和MRP2 mRNA表达水平上升(P均0.05),高剂量砷+5-Aza-DC组的As3MT mRNA表达水平下降(P=0.023)。4.蛋白水平:1)家兔血液中,与对照组比较,低剂量砷组Nrf2、高剂量砷组MRP2蛋白表达上升(P均0.05),低剂量砷组Keap1和Bach1蛋白表达水平降低(P均0.05)。2)家兔皮肤中,与对照组相比,低、中和高剂量砷组Nrf2的蛋白表达上升,Keap1蛋白表达下降(P均0.05),且随着砷剂量的升高,Nrf2的蛋白表达水平逐渐上升,Keap1的蛋白表达与之相反;中剂量砷组的Bach1的的蛋白表达水平下降(P0.005),低和高剂量砷组MRP2的蛋白表达水平上升(P0.05);与低剂量砷组相比,低剂量砷组+SFP组的Nrf2蛋白表达上升、Keap1和Bach1的蛋白表达下降,低剂量砷组+5-Aza-DC的Nrf2、Keap1和Bach1蛋白表达下降;与中剂量砷组相比,加入5-Aza-DC后As3MT蛋白表达下降,加入SFP后MRP2蛋白表达明显升高。结论:砷可以激活Nrf2/Keap1信号通路,促进Nrf2下游的相关抗氧化指标和砷代谢指标的表达。莱菔硫烷和5-杂氮-2′-脱氧胞苷可调控Nrf2通路,其中莱菔硫烷作为Nrf2的激活剂,能减轻机体氧化损伤,而5-杂氮-2′-脱氧胞苷主要通过抑制砷甲基化代谢酶的活性,加重机体氧化损伤,但其详细的作用机制还需进一步研究。
【学位单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R135.1
【部分图文】：

溶解曲线,血液,家兔,基因扩增

γP＜0.05图2 分别为家兔血液GAPDH基因扩增曲线、溶解曲线和溶解峰Fig.2 Rabbit blood Gapdh gene amplification curve, dissolution curve and dissolved peak

溶解曲线,家兔,基因扩增,血液

26图3 分别为家兔血液Nrf2基因扩增曲线、溶解曲线和溶解峰Fig.3 Rabbit blood Nrf2 gene amplification curve, dissolution curve and dissolved peak图4 分别为家兔血液Keap1基因扩增曲线、溶解曲线和溶解峰Fig.4 Rabbit blood Keap1 gene amplification curve, dissolution curve and dissolved peak图5 分别为家兔血液Bach1基因扩增曲线、溶解曲线和溶解峰Fig.5 Rabbit blood Bach1 gene amplification curve, dissolution curve and dissolved peak结果显示，各组家兔血中As3MT mRNA表达水平总体均数不全相等（F=3.31，P=0.031）。与空白对照组比较，高剂量砷组As3MT mRNA表达水平上升，差异有统计学意义（P=0.044）。与低剂量砷组相比，高剂量砷组As3MT mRNA表达水平上升，差异有统计学意义（P=0.006），与?

溶解曲线,家兔,基因扩增,血液

图3 分别为家兔血液Nrf2基因扩增曲线、溶解曲线和溶解峰Fig.3 Rabbit blood Nrf2 gene amplification curve, dissolution curve and dissolved peak图4 分别为家兔血液Keap1基因扩增曲线、溶解曲线和溶解峰Fig.4 Rabbit blood Keap1 gene amplification curve, dissolution curve and dissolved peak图5 分别为家兔血液Bach1基因扩增曲线、溶解曲线和溶解峰Fig.5 Rabbit blood Bach1 gene amplification curve, dissolution curve and dissolved peak结果显示，各组家兔血中As3MT mRNA表达水平总体均数不全相等（F=3.31，P=0.031）。与空白对照组比较，高剂量砷组As3MT mRNA表达水平上升，差异有统计学意义（P=0.044）。与低剂量砷组相比，高剂量砷组As3MT mRNA表达水平上升，差异有统计学意义（P=0.006），与中剂量

【参考文献】