砷暴露与糖尿病发病的关系及GSK-3β在其中的作用

发布时间：2020-09-03 15:53

　　作为环境污染物,砷(Arsenic,As)暴露可导致生殖异常、内分泌紊乱、心血管疾病等慢性疾病,甚至是癌症。糖尿病(diabetes mellitus,DM)作为慢性疾病的头号杀手,早已受到国内外的广泛关注。近年来有研究表明,饮水砷暴露可能增加糖尿病的发病风险。我国面临着大面积的环境砷暴露,燃煤砷暴露是其特色。燃煤砷暴露可污染水、食物、空气,从而导致疾病的发生。据统计,燃煤砷暴露和糖尿病的关联性还未有研究报道证实。本研究开展了燃煤砷暴露地区的流行病学调查,通过性别和年龄配对的病例对照,检测糖尿病人及非糖尿病人群尿砷水平并分析其与和糖尿病患病的关系;探讨燃煤砷暴露和2型糖尿病是否存在关联性。旨在为砷暴露与糖尿病发病的关系提供流行病学证据。糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发生和发展过程中有重要作用。2型糖尿病患者的骨骼肌和外周组织中,GSK-3β蛋白活性明显升高。GSK-3β通过糖原合成途径参与调节糖代谢过程,同时又参与调控磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phishoinositide 3-kinase/Protein kinaseB,PI3K/AKT)通路和胰岛素反应。然而砷暴露糖尿病人中GSK-3β蛋白活性变化的研究鲜见报道。因此本研究通过检测不同砷暴水平糖尿病人群及非糖尿病人群血清中GSK-3β表达水平及活性情况,并建立砷致糖代谢紊乱的大鼠模型,通过GSK-3β抑制剂干预后探讨GSK-3β在砷致糖尿病发病中的可能作用。第一部分:砷暴露与2型糖尿病的病例对照研究目的:探讨砷暴露与糖尿病的关联性及不同砷暴露水平人群血清中GSK-3β表达水平。方法:本研究在贵州省安龙县开展了燃煤砷暴露与糖尿病的1:1年龄和性别的病例对照研究。2型糖尿病病例组和正常对照组各232人。通过一对一问卷调查收集研究对象的人口学特征,经专业护士人员采集空腹血和收集晨尿。全自动生化分析仪检测血清中空腹血糖(Fsteing blood glucose,FBG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三脂(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、肌酐(Creatinine,CRE)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、白蛋白(Albumin,ALB)等生化指标。原子荧光分光光度计检测尿液和全血中砷含量,以尿砷含量定义砷暴露情况,我国尿砷安全指导限值为32μg/L,将尿砷水平大于32μg/L作为人群既往有砷暴露,低于32μg/L作为非砷暴露。ELISA检测人群对照组(Control)、2型糖尿病组(T2DM)、砷暴露未患2型糖尿病组(As-Control)和砷暴露患2型糖尿病组(As-T2DM)样本血清GSK-3β和磷酸化糖原合成酶激酶-3β(Phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,P-GSK-3β),以P-GSK-3β/GSK-3β比值表示GSK-3β蛋白活性。采用logistic回归,计算砷暴露和糖尿病之间的比值比(Odds Radio,OR)和95%置信区间(Confidence interval,CI),分析砷暴露和糖尿病发病风险的关联性。亚组分析探讨砷暴露和糖尿病潜在的效应修饰因素。结果:砷暴露和糖尿病的单因素logistic回归结果中,砷暴露与糖尿病发病高风险显著相关(OR=2.09,95%CI:1.44~3.03)。经多个模型调整了混杂因素,砷暴露与糖尿病发病高风险仍显著相关(OR=2.01,95%CI:1.4~3.0)。不同尿砷水平与糖尿病的关联性不同,高尿砷水平患糖尿病的风险更大(OR=2.68,95%CI:1.45~4.80)。进一步亚组分析发现在体质指数(Body mass index,BMI)≥25kg/m~2,TG≥1.7mmol/L,ALT40U/L,CRE97μmol/L的人群中砷暴露与糖尿病发病风险的关联强度更加明显(P_(interaction)0.05)。ELISA结果显示,T2DM-As组P-GSK-3β/GSK-3β比值的中位数为0.22,低于Control、T2DM、Control-As组,T2DM-As组GSK-3β蛋白活性高于Control、T2DM、Control-As组(P0.05)。结论:砷暴露可显著增加糖尿病的发病风险,这可能与砷进入体内后GSK-3β活性增强有关。第二部分GSK-3β在砷致糖代谢紊乱中的作用目的:鉴于人群实验发现砷暴露与GSK-3β蛋白活性存在相关性,及GSK-3β对糖尿病发生、发展有很重要的关系,所以本研究建立砷致糖代谢紊乱大鼠模型,探究GSK-3β在砷致糖尿病中的可能作用。方法:选择健康清洁级SD雄性大鼠60只,体重200±20g,采用随机数字表法将其分为6组,通过饮水砷染毒;Control组,5mg/kg As组、10mg/kg As组、15mg/kg Licl组、5mg/kg As+15mg/kg Licl组、10mg/kg As+15mg/kg Licl组,每组10只。每周检测大鼠空腹血糖两次;至第13周,空腹抽取眼眶血检测大鼠糖化血红蛋白和胰岛素;与对照组比较,各染砷组鼠出现糖代谢指标差异后,15mg/kg Licl组、5mg/kg As+15mg/kg Licl组、10mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠腹腔隔天注射GSK-3β抑制剂(15mg/kg Li Cl)。15周后处死大鼠,HE染色镜下观察大鼠肝脏组织病理学变化;原子荧光光度计检测血、尿、各组织、毛发砷含量;ELISA检测大鼠血清胰岛素;计算各组大鼠胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感指数;RT-q PCR检测大鼠肝脏组织GSK-3βm RNA表达水平,Western Blot检测大鼠肝脏GSK-3β、P-GSK-3β蛋白表达水平。以P-GSK-3β/GSK-3β比值表示GSK-3β蛋白活性。结果:1.大鼠砷暴露13周后,与Control组比较,各染砷组大鼠空腹血糖增加(P0.05),各染砷组大鼠空腹糖化血红蛋白增加(P0.05),各染砷组大鼠空腹胰岛素均降低(P0.05)。与Control组比较,各染砷组大鼠胰岛素抵抗指数增加(P0.05),各染砷组大鼠胰岛素敏感指数降低(P0.05)。2.大鼠砷暴露15周且15mg/kg Licl组、5mg/kg As+15mg/kg Licl组和10mg/kg As+15mg/kg Licl组腹腔注射GSK-3β抑制剂(Li Cl)两周后,与Control组比较,5mg/kg As组、10mg/kg As组大鼠血糖仍增加(P0.05);5mg/kg As+15mg/kg Licl组、10mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠血糖与对照组无差异(P0.05)。5mg/kg As组、10mg/kg As组大鼠空腹胰岛素低于Control组(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl组空腹胰岛素高于5mg/kg As组(P0.05),10mg/kg As+15mg/kg Licl组空腹胰岛素高于10mg/kg As组(P0.05)。3.与Control组比较,5mg/kg As组、10mg/kg As组大鼠胰岛素抵抗指数增加和胰岛素敏感指数降低(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl组胰岛素抵抗指数组低于5mg/kg As组;5mg/kg As+15mg/kg Licl胰岛素敏感指数组高于5mg/kg As组;10mg/kg As+15mg/kg Licl胰岛素敏感指数组高于10mg/kg As组。4.与Control组比较,10mg/kg As、10mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠肝脏、脾脏、肾脏和胰腺的脏器系数增大(P0.05),5mg/kg As、5mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠肾脏的脏器系数增大(P0.05)。5.与Control组比较,10mg/kg As、10mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠肝脏结构异常,肝细胞索排列紊乱伴有水肿,汇管区可见明显的炎性细胞浸润。6.与Control组比较,5mg/kg As和10mg/kg As组大鼠肝脏GSK-3βmRNA表达水平增高(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl和10mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠肝脏GSK-3βm RNA表达水平无差异(P0.05);与10mg/kg As组比较,10mg/kg As+15mg/kg Licl组GSK-3βm RNA表达水平降低(P0.05)。7.各组大鼠GSK-3β蛋白水平无明显变化。与Control组比较,5mg/kg As和10mg/kg As组大鼠肝脏Ser9-GSK-3β蛋白水平降低(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl和10mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠肝脏Ser9-GSK-3β蛋白水平无差异(P0.05);与5mg/kg As组比较,5mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠Ser9-GSK-3β蛋白水平增高(P0.05);与10mg/kg As组比较,10mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠Ser9-GSK-3β蛋白水平增高(P0.05)。8.与Control组比较,5mg/kg As和10mg/kg As组Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值降低,GSK-3β蛋白活性增高(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl和10mg/kg As+15mg/kg Licl组大鼠肝脏Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值无差异(P0.05)。与5mg/kg As组比较,5mg/kg As+15mg/kg Licl组Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值增高,GSK3β蛋白活性降低(P0.05)。与10mg/kg比较,10mg/kg As+15mg/kg Licl组Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值增高,GSK3β蛋白活性降低(P0.05)。结论:砷可能通过抑制GSK-3β的Ser9位点磷酸化,增强GSK-3β蛋白活性,进而发生胰岛素抵抗和/或胰岛素分泌减少,血糖升高,引起糖代谢紊乱。
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.1;R114
【部分图文】：

尿砷,人群,和血,预测因素

图 1 研究人群尿砷和血砷水平Fig.1 The study population urinary arsenic and blood arsenic level.2 糖尿病预测因素的单因素 Logistic 回归分析糖尿病预测因素单因素 Logistic 回归分析结果分析发现，BMI、WHtR、TG、

亚组分,风险,血清,人群

图 2 砷暴露与糖尿病发病风险的亚组分析结果Fig.2 The results subgroup analyses on the association of arsenic exposure with the risk ofdiabets2.4 不同人群血清 GSK-3β 和 P-GSK-3β 表达情况检测不同砷暴露水平人群血清 GSK-3β 和 P-GSK-3β 浓度发现，T2DM-As

图 3 不同人群血清 GSK-3β、P-GSK-3β 和 P-GSK-3β/GSK-3β 差异Fig.3 Differences of serum GSK-3β, P-GSK-3β and P-GSK-3β/GSK-3β in differentpopulations3 讨论

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