乙醇与1,2-二氯乙烷联合暴露对小鼠肝和脑组织的损伤作用及其机制研究

发布时间：2020-09-03 21:56

　　目的:1,2-二氯乙烷(1,2-dichloroethane,1,2-DCE)常温下是一种无色、无味、高挥发性的油状液体,属于高毒类。在工业生产中,1,2-DCE主要用于合成聚氯乙烯的单体。此外,作为有机溶剂也被广泛应用于粘合剂、脱脂剂和清洗剂等。作为有机溶剂,1,2-DCE极易挥发,主要通过呼吸道进入人体,并被快速吸收入血。由于具有脂溶性,1,2-DCE易于通过BBB进入脑组织。尽管已有150多年的使用历史,但在1990年以前,国内外有关职业接触1,2-DCE导致中枢神经系统损伤的人群和动物研究资料均极少~([1])。但自1990年以后,由于作为粘合剂广泛应用于玩具、塑料和制鞋等行业,从广东省开始,在我国的多个省市陆续发生亚急性1,2-DCE职业中毒事故,临床表现以中毒性脑病和肝损伤为主。目前,亚急性1,2-DCE职业中毒已成为严重危害我国劳动者健康与生命的新职业病危害。然而,有关1,2-DCE亚急性毒性的资料仍很缺乏,亟待进行深入研究。研究资料显示,细胞色素(Cytochrome)P450 2E1(CYP2E1)是介导体内低分子化合物,特别是卤代烃类化合物代谢的关键酶,且大多数卤代烃类化合物在代谢过程中可促使CYP2E1表达上调。1,2-DCE经CYP2E1代谢可生成化学性质更活跃的中间产物氯乙醛和2-氯乙醇,最终被代谢为氯乙酸随尿液排出体外。与其它CYP450亚型相比,CYP2E1具有更强的NADPH氧化酶活性,在催化底物代谢的过程中易出现电子传递的解偶联现象,产生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),进而引起细胞的氧化损伤。我们前期的研究结果表明1,2-DCE染毒可使小鼠肝和脑组织中CYP2E1的表达上调,并引起小鼠肝和脑组织的氧化损伤。目前认为,CYP2E1是CYP450的一个亚型,主要分布在肝小叶中心区域,约占CYP450总量的7%。然而,大量研究数据显示,在人和实验动物的肝外组织中也有CYP2E1的表达分布。特别是脑组织的嗅球、海马、小脑以及大脑额叶皮质等区域的神经元和胶质细胞中有相对较高水平CYP2E1表达。乙醇是公认的CYP2E1特异性诱导剂。有研究报道,急性和慢性乙醇暴露均可导致肝和脑组织中CYP2E1蛋白水平和酶活性升高。乙醇在CYP2E1催化下生成乙醛和乙酸。乙醛是乙醇体内代谢的活性中间产物,可以与蛋白质和DNA等生物大分子反应产生加合物,是导致组织细胞损伤的重要原因。有研究证实,乙醇引起的脑组织损伤区域与其诱导CYP2E1高表达区域密切相关,这提示乙醇在脑组织的代谢是其产生神经毒性的主要原因[20,21]。已有研究证明,乙醇通过上调CYP2E1的蛋白水平和酶活性促进氯仿和四氯化碳等卤代烃化合物的代谢,并加重该类化学物引起的肝损伤。基于以上研究成果和我们的研究发现,我们推测乙醇和1,2-DCE联合暴露会加重肝和脑组织的损伤,导致酗酒工人对1,2-DCE毒性损伤的敏感性增强。综上所述,本研究拟以昆明种小鼠为实验对象,模拟饮酒工人职业暴露1,2-DCE的情况,在整体动物水平通过联合给予乙醇与1,2-DCE,探讨乙醇与1,2-DCE的联合暴露在引起小鼠肝和脑组织的损伤方面是否存在交互作用,为揭示1,2-DCE对饮酒工人的健康影响,为1,2-DCE职业中毒的防治工作提供实验参考数据。方法:1、实验动物1.1分组1.1.1动物选择:健康、性成熟、清洁级雌性昆明种小鼠60只,体重20-24克,适应性喂养一周。建立不同浓度乙醇与1,2-DCE联合暴露模型。实验动物随机分为6组,分别是空白对照组、乙醇对照组、1,2-DCE单纯染毒组及低、中和高剂量乙醇与1,2-DCE联合暴露组,每组10只小鼠。1.1.2处理(1)染毒前处理模型中,1,2-DCE染毒前3d,乙醇对照组和联合暴露组小鼠每天灌胃给予含乙醇3.0、0.75、1.5或3.0 g/Kg bw的水溶液0.2 ml,空白对照组和1,2-DCE单纯染毒组小鼠每天灌胃给予蒸馏水0.2 ml。(2)染毒模型中,各组小鼠灌胃后4 h,采用静式吸入方式染毒,将小鼠置于100 L的染毒柜中3.5 h/d,连续染毒3d。单纯染毒组和联合暴露组的染毒柜中1,2-DCE浓度为1.0 g/m~3,空白对照组和乙醇对照组的染毒柜中不加入1,2-DCE。于末次染毒结束后的次日处死小鼠,快速取出血、肝脏和脑组织,检测如下指标。2、指标测定2.1脑脏器系数和脑含水量取脑组织,称重。脑脏器系数=脑组织重量/小鼠体重。分离大脑半球,取左侧大脑组织,用1/10000的分析天平称其湿重,将其放入100℃恒温烤箱中,烘烤48h至恒重后称取干重。脑含水量(%)=(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100%。2.2小鼠脑和肝组织病理学观察取大脑和肝组织,经4%多聚甲醛液固定72 h,常规石蜡包埋,脑组织连续冠状切片,常规HE染色,光镜下观察脑和肝组织病理变化。2.3血清中ALT和AST活性:采用生化试剂盒法。2.4肝和脑组织中GSH和MDA含量及SOD活性:采用生化试剂盒法。2.5脑组织中CYP2E1、ZO-1、Occludin、AQP4、Nrf2、HO-1、g-GCSc、GR和g-GCSm蛋白和m RNA含量:Western blot法和Real time RT-PCR法。2.6肝组织中CYP2E1、Nrf2、HO-1、g-GCSc、GR和g-GCSm蛋白和m RNA含量:Western blot法和Real time RT-PCR。3、统计分析实验数据采用SPSS 16.0进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用q检验(SNK)。以P0.05作为差异有统计学意义的判定标准。结果:1、中毒表现空白对照组、乙醇对照组和1,2-DCE单纯染毒组的小鼠未见明显的中毒症状。而联合暴露组的部分小鼠出现了肢体震颤和四肢不能完全伸展等症状,将小鼠尾巴轻轻提起,使小鼠头朝下悬空时,小鼠的四肢不能完全伸展,出现双前肢和/或双后肢相互交叉的抱爪现象。低、中和高剂量联合暴露组小鼠的脑损伤(抱爪和死亡)行为学改变率分别为20%(2/10)、50%(5/10)、50%(5/10),且只在高剂量联合暴露组出现死亡(20%)。2、脑水肿相关指标的改变与对照组相比,中和高剂量联合暴露组小鼠的脑脏器系数显著升高(P0.05)。脑含水量随着乙醇暴露剂量增加而增加,而与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);此外,中、高剂量联合暴露组小鼠的脑组织呈现细胞间质疏松,细胞核周围腔隙增宽,胞浆淡染,胞体肿胀变性,边缘模糊;部分细胞及毛细血管周围腔隙扩张的脑水肿典型病理改变。3、肝损伤相关指标的改变低、中、高剂量联合暴露组小鼠呈现肝损伤病理改变;与对照组相比,中、高剂量联合暴露组小鼠血清中AST活性明显升高(P0.05);与对照组、乙醇对照组相比,联合暴露组ALT活性明显升高(P0.05)。4、肝和脑组织中氧化应激相关指标的改变4.1肝组织中氧化应激相关指标的改变与对照组相比,联合暴露组小鼠GSH含量显著下降(P0.05);与对照组、乙醇对照组相比,联合暴露组MDA含量明显升高(P0.05);各组SOD活性变化无明显差异(P0.05)。4.2脑组织中氧化应激相关指标的改变与对照组、乙醇对照组、1,2-DCE单纯染毒组相、低剂量联合暴露组相比,中、高剂量联合暴露组MDA含量明显升高(P0.05),乙醇与1,2-DEC对MDA指标水平具有协同作用;各组GSH含量、SOD活性变化无明显差异(P0.05)。5、乙醇与1,2-二氯乙烷联合暴露肝脑损伤发生机制5.1乙醇与1,2-DCE联合暴露对小鼠血脑屏障相关蛋白及m RNA的影响联合暴露组小鼠脑组织中Occludin、ZO-1蛋白出现不同程度含量下降,中、高剂量联合暴露组下降趋势更明显,在m RNA水平也检测到相同趋势;乙醇与1,2-DEC对脑损伤Occludin、ZO-1蛋白表达水平具有协同作用,对脑组织Occludin、ZO-1m RNA表达水平具有协同作用。5.2乙醇与1,2-DCE联合暴露对小鼠AQP4蛋白及m RNA的影响联合暴露组小鼠脑组织中AQP4蛋白出现不同程度含量下降,中、高剂量联合暴露组下降趋势更明显,在m RNA水平也检测到相同趋势。乙醇与1,2-DEC对脑组织AQP4m RNA表达水平具有协同作用。5.3乙醇与1,2-DCE联合暴露对CYP2E1的影响联合暴露组小鼠肝脑组织中CYP2E1蛋白出现不同程度的含量升高趋势,中、高剂量联合暴露组升高更显著,在m RNA水平也检测到上述相同趋势;乙醇与1,2-DEC对肝组织CYP2E1m RNA指标具有协同作用,乙醇与1,2-DEC对脑组织CYP2E1蛋白、m RNA指标具有协同作用。5.4乙醇与1,2-DCE联合暴露对小鼠NRF2信号通路相关蛋白及m RNA的影响联合暴露组小鼠肝脑组织中Nrf2、HO-1、γ-GCSc、GR蛋白出现不同程度的含量升高趋势,中、高剂量联合暴露组升高更显著,在m RNA水平也检测到上述相同趋势,而γ-GCSm在蛋白水平与基因水平均未检测到显著变化;乙醇与1,2-DEC对脑组织Nrf2蛋白指标具有协同作用,对肝组织Nrf2、γ-GCSc、GR蛋白指标具有协同作用,对肝、脑组织Nrf2、HO-1、γ-GCScm RNA指标具有协同作用。结论:1、乙醇与1,2-DCE联合暴露能够引起肝、脑联合毒作用,且乙醇增强1,2-二氯乙烷诱导肝脑损伤,随着乙醇暴露剂量增加,呈剂量效应关系。2、乙醇与1,2-DCE联合毒作用引起肝脑损伤,可能机制与乙醇增强1,2-二氯乙烷诱导表达CYP2E1,增加二氯乙烷代谢,产生大量活性氧自由基,产生氧化应激,引起肝、脑氧化损伤有关。3、乙醇与1,2-DCE联合毒作用引起肝、脑氧化应激进一步激活Nrf2信号通路,使机体大量表达抗氧化蛋白酶HO-1、γ-GCSc、GR。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R114
【部分图文】：

微粒体,相对含量,蛋白,对照组

20图 3.2 各组小鼠肝微粒体中 CYP2E1 蛋白及 mRNA 相对含量比较（x± s，n=4）注：*P＜0.05，与对照组比较；＆P＜0.05，与乙醇对照组比较；#P＜0.05，与 1,2-DCE 单纯染毒组比较； P＜0.05，与低剂量联合暴露组比较。A: 对照组；B: 乙醇对照组；C:1,2-DCE 单纯染毒组；D: 低剂量联合暴露组；E: 中剂量联合暴露组；F: 高剂量联合暴露组。

相对含量,析因,微粒体,蛋白

图 3.3 析因作用分析各组小鼠肝微粒体中 CYP2E1 蛋白及 mRNA 相对含量（x± s，n=4）注：A: 对照组；B: 乙醇对照组；C: 1,2-DCE 单纯染毒组； F: 高剂量联合暴露组。3.6 乙醇与 1,2-DCE 联合暴露对肝组织中 Nrf2 信号通路的影响3.6.1 肝脏组织中 NRF2 蛋白及 mRNA 相对含量图 3.4 显示，乙醇对照组、1,2-DCE 单纯染毒组 NRF2 蛋白相对含量分别与对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），而低、中、高剂量联合暴露组 NRF2 蛋白相对含量与对照组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；低、中、高剂量联合暴露组 NRF2 蛋白相对含量与乙醇对照组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；低、中、高剂量联合暴露组 NRF2 蛋白相对含量与 1,2-DCE 单纯染毒组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；中、高剂量联合暴露组 NRF2 蛋白相对含量分别与低剂量联合暴露组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。乙醇对照组、1,2-DCE 单纯染毒组 NRF2 mRNA 相对含量分别与对照组比

相对含量,对照组,低剂量,蛋白

23注：*P＜0.05，与对照组比较；＆P＜0.05，与乙醇对照组比较；#P＜0.05，与 1,2-DCE 单纯染毒组比较； P＜0.05，与低剂量联合暴露组比较；$P＜0.05，与中剂量联合暴露组比较。A:对照组；B: 乙醇对照组；C:1,2-DCE 单纯染毒组；D: 低剂量联合暴露组；E: 中剂量联合暴露组；F: 高剂量联合暴露组。

【参考文献】