环境污水中轮状病毒、诺如病毒和星状病毒的监测与分子流行病学研究

发布时间：2020-09-10 18:46

　　 [背景]胃肠炎是人类最常见疾病之一,主要临床症状为恶心、呕吐、腹泻、腹痛等,在免疫力低下的婴幼儿和老年人群中常可引起脱水和电解质紊乱症状,是婴幼儿和老年人住院或死亡的常见病因。目前引起人类胃肠炎的病原种类繁多,其中轮状病毒(Rotavirus,RoV)、诺如病毒(Norovirus,NoV)和人星状病毒(Human Astrovirus,HAstV)是导致人类病毒性胃肠炎的主要病原。RoV分为A～G 7组,其中A、B和C组可感染人类,A组RoV(RVA)更是引起全球范围内散发性胃肠炎的主要病毒;根据其VP4和VP7基因序列的不同,RVA至少可分为35个P基因型和27个G基因,其中G1～G4,P[8]和P[4]为主要流行型别。NoV在病毒性胃肠炎患者中检出率仅次于RVA,是急性胃肠炎暴发的主要病原;根据VP1氨基酸序列的差异,NoV至少可分为7个基因组(GⅠ～GⅦ)和40个基因型,其中GⅠ、GⅡ和GⅣ可感染人类,导致胃肠炎发生;GⅡ.4每两年左右便会出现新的变异株,并在人群中引起流行,是最重要的NoV基因型之一。HAstV在临床病例中检出率低于RVA和NoV,可分为8个血清型,其中HAstV-1为世界范围内主要流行型别。RVA、NoV和HAstV基因型别众多,变异频繁,在不同人群、不同地区、不同时间内往往呈现不同的流行特征,对其开展监测分析和分子流行病学研究,有助于采取有针对性的预防控制措施,进而减少相关疾病负担。目前国外病毒性胃肠炎的监测仍然以基于医院的临床病例监测为主,而环境污水监测作为一种新兴的病毒监测方式,已在肠道病毒(Enterovirus,EV)分子流行病学研究中得到较好应用。鉴于粪-口途径为胃肠炎病毒的主要传播方式,感染者体内的病毒颗粒最终汇入城市污水处理厂,污水也就成为人类感染的重要来源。因此,胃肠炎病毒的环境污水监测可作为其分子流行病学研究的重要补充。我国目前尚未建立完善的病毒性胃肠炎临床病例监测体系,有限的RVA、NoV和HAstV分子流行病学数据只能从零散的病例报道中获取,成为阻碍我国病毒性胃肠炎防控工作的瓶颈之一。而环境污水监测作为一种独立于临床病例监测之外的监测途径,不仅符合当今公共卫生领域提出的“同一个世界,同一个健康(One World,One Health)”的理念,也有望成为我国RVA、NoV和HAstV监测和分子流行病学的重要研究方法。[目的]1.对环境污水中RVA、NoV和HAstV相关基因进行扩增和定型,确定2013～2016年度山东省监测地区上述病毒型别分布和时间动态变化特征,构建RVA、NoV和HAstV基因数据库,为开展分子流行病学研究提供本底资料。2.对获得的上述3种病毒序列开展系统发生学研究,探讨监测地区内流行的RVA、NoV和HAstV与国内外其他地区参考序列的系统发生关系。3.分析山东省监测地区RVA、NoV和HAstV优势型别序列基因重组情况及基因起源、进化速度等进化遗传学特征。[方法]1.选择山东省济南、临沂和烟台3个市为监测地区,于2013～2016年采用定时采样法,按月收集上述3个市污水处理厂入水口处环境污水标本,并使用阴离子膜吸附洗脱法进行浓缩富集。2.提取病毒核酸,采用特异性引物扩增RVA、NoV和HAstV分子定型区基因片段,阳性产物经回收纯化、TA克隆后测序定型。3.使用BioEdit 7.1.9软件,将本研究获取序列与GenBank数据库下载参考序列进行比对,分析核苷酸和氨基酸同源性;采用Mega5.02软件,计算序列间遗传距离,并基于邻接法(Neighbor-Joining Method)构建RVA、NoV和HAstV山东序列和国内外参考序列的系统发生树,对本研究获取的RVA、NoV和HAstV序列进行系统发生学分析。4.采用RDP 4.0软件分析RVA、NoV和HAstV序列的重组情况。5.基于贝叶斯马尔可夫链蒙特卡洛(Bayesian Markov Chain Monte Carlo,MCMC)方法,采用BEAST 1.7.5软件对本研究获取的RVA、NoV和HAstV序列进行进化遗传学分析,估计其进化速率、最近共同祖先起源时间(The Time To The Most Recent Common Ancestor,TMRCA)等进化遗传学特征。[结果]1.环境污水中RVA、NoV和HAstV的检出情况2013～2016年,共收集上述3个市环境污水标本132份,其中RVA G和P基因型检出率分别为90.9%和89.4%,NoV GⅠ和GⅡ的检出率分别为100.0%和97.0%,HAstV 检出率为 81.8%。2.RVA、NoV和HAstV的基因型分布特征本研究共获取RVA G基因序列758条,分属G2、G3、G4、G6、G8、G9和G11共7个基因型,其中G9序列最多,占91.4%(693/758)。获得的950条RVA P基因序列分属 P[3]、P[4]、P[6]、P[8]、P[9]、P[14]和 P[23]共 7 个基因型,其中 P[8]和 P[4]为优势型别,分别占 53.7%(510/950)和 39.1%(371/950)。获得的 1138 条 NoVGⅠ 基因序列分属 GⅠ.1、GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.4、GⅠ.5、GⅠ.6、GⅠ.8和GⅠ.9共8个基因型,其中GⅠ.6最多(占44.1%,502/1138),且2014年后,3个市主导基因型均由GⅠ.2转换成GⅠ.6。886条NoV GⅡ基因序列分属14个基因型,分别为 GⅡ.1、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.5、GⅡ.6、GⅡ.8、GⅡ.9、GⅡ.10、GⅡ.13、GⅡ.14、GⅡ.15、GⅡ.17 和 GⅡ.21,其中 GⅡ.17、GⅡ.3、GⅡ.4 和 GⅡ.6 为优势流行基因型,分别占 39.0%(345/886)、27.1%(240/886)、12.2%(108/886)和 8.7%(77/886)。获得的526条HAstV基因序列分属5个基因型,即HAstV-1～HAstV-5,其中HAstV-5最高(占45.4%,239/526),且在2015年后,3个市主导基因型呈现由HAstV-1向HAstV-5转换趋势。3.RVA、NoV和HAstV优势型别的同源性和系统发生学分析从环境污水中获取的RVAG9、P[8]和P[4]序列间同源性较低,系统发生学分析显示上述基因型在监测地区存在多个传播链的共循环。NoV GⅠ.2序列间同源性较高,在系统发生树上聚集为一簇,而GⅠ.6核酸和氨基酸差异大,系统发生树显示其分为2个进化分支;NoV GⅡ.4序列属于Den Haag 2006b和Sydney 2012变异株,但Den Haag 2006b变异株仅在2014年济南市标本中检出;自2015年起,环境污水中检出的GⅡ.17全部变为Kawasaki 2014变异株,提示这一新型变异株在当地的流行;此外,我们还在2014年烟台市标本中发现GⅡ.17 Hong Kong2015变异株。获取的HAstV-1和HAstV-5序列之间核酸和氨基酸同源性同样较低,且在当地存在多个传播链的共循环。4.重组分析本研究共检出4条RVA重组序列,分别为G9型内重组、P[8]型内重组和P[4]/P[8]间重组。NoVGⅠ重组序列有11条,呈现6种重组形式,其中GⅠ.2/GⅠ.5重组序列最多;NoV GⅡ重组序列有3条,且只有GⅡ.3/GⅡ.6 一种重组形式。HAstV重组序列多达36条,其中HAstV-1/HAstV-5为最常见的重组组合。5.RVA、NoV和HAstV优势型别的进化遗传学分析进化遗传学分析结果显示,G9序列起源时间为1970.6年,并以1.3×10-3s/s/y(Nucleotide Substitutions Per Site Per Year)速率进化;P[8]的进化速率大于 P[4],且拥有更早的起源时间。NoV GⅠ.6的进化速率同样大于GⅠ.2,且具有更早的起源时间;NoVGⅡ.4最近共同祖先起源于1983.4年,进化速率为3.6×10-3s/s/y;GⅡ.17则起源于1956.5年,进化速率为2.8×10-3s/s/y。本研究还首次报道了HAstV-1和HAstV-5进化遗传学特征,它们的起源时间分别为1960.4和1993年,进化速率分别为1.3×10-3 s/s/y和4×10-3 s/s/y。[结论]1.本次研究监测地区环境污水中RVA、NoV和HAstV序列的检出率很高,提示上述病毒在监测地区人群处于较高的流行强度。2.在本次研究的监测地区,G9、P[8]和P[4]为RVA主要G、P基因型;GⅠ.2、GⅠ.6 和 GⅡ.17、GⅡ.3、GⅡ.4 为 NoV GⅠ、GⅡ 优势基因型;HAstV-1 和 HAstV-5为HAstV优势型别。上述型别在监测地区存在多个传播链共循环现象。3.本次研究的监测地区,目前流行的NoV GⅡ.4变异株主要为Sydney 2012变异株,但2014年济南市曾出现Den Haag2006b变异株流行,应继续监测Den Haag 2006b变异株是否仍在当地流行。2015年后环境污水标本中检出的GⅡ.17全部变为Kawasaki 2014变异株,证实这一新型变异株在山东省监测地区的流行。4.在本次研究期间,NoV GⅠ和HAstV的优势基因型均出现型别转换现象,系统发生学分析显示当地并未出现新的变异株,提示人群免疫水平变化等因素可能是导致这一现象发生的主要原因。5.本次研究发现,基因重组在RVA、NoV和HAstV基因序列中均有检出,提示多个传播链和基因型共循环而产生的混合感染现象在监测地区较为普遍。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R181.3
【部分图文】：

２４．６％邋（９９／４０３）、１６．６％邋（６７／４０３）和邋１１．２％邋（４５／４０３）。随着监测时间的持续，逡逑自２０１４年末开始，ＧＩ．６检出比例呈逐渐增加趋势，而ＧＩ．２、ＧＩ．３和ＧＩ．５呈下降逡逑趋势，见图４（八）。２０１５年后获取的0１．６序列数占0１．６总序列数的９２．３％（１３１／１４２）。逡逑临沂市共获得邋４１２邋条序列，分属邋ＧＩ．ｌ、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．４、ＧＩ．５、ＧＩ．６、ＧＩ．８逡逑和邋ＧＩ．９邋共邋８邋个基因型。其中邋ＧＩ．６邋占邋４５．１％邋（１８６／４１２），ＧＩ．３、ＧＩ．５邋和邋ＧＩ．２邋分别逡逑占邋１５．５％邋（６４／４１２）、１３．１％邋（５４／４１２）和邋１２．１％邋（５０／４１２）。在邋２０１４邋年后，ＧＩ．６逡逑？逦替代之前的ＧＩ．２、ＧＩ．３和ＧＩ．５，成为检出比例最高的基因型，见图４邋（Ｂ）？邋２０１４逡逑年后所获ＧＩ．６序列数占ＧＩ．６总序列数比例高达９９．０％邋（１８４／１８６）。逡逑烟台市共获得邋３２３邋条序列，分属邋ＧＩ．ｌ、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．４、ＧＩ．５、ＧＩ．６邋和邋ＧＩ．９逡逑共７个基因型。其中0１．６占５３．９％（１７４／３２３），0１．５、0１．２和0１．３分别占１５．２°／０逡逑（４９／３２３）、１０．２％邋（３３／３２３）和邋９．９％邋（３２／３２３）。同样，自邋２０１４邋年末起，ＧＩ．６邋替逡逑代之前的ＧＩ．２、ＧＩ．３和ＧＩ．５

４．１逦ＲＶＡ逡逑经同源性比较和遗传距离曲线分析，共发现４条ＲＶＡ重组序列（遗传距离逡逑曲线见图１６），呈现３种重组形式，分别为Ｇ９型内重组、Ｐ［８］型内重组和Ｐ［４］／Ｐ［８］逡逑序列间重组。重组序列具体特征见表１４，其中临沂市未检出重组序列。逡逑ＯＣＯＯＯＯ邋■逦逦邋逦邋ｒｒ３Ｕ－？ＦＷａｉ１３ｌｃａｎｎＭａ？ａｎ＜逦０邋０００００邋．逦＞ｃ？ｒ＞Ｍ逡逑－ＶＴ３？５－２ｆ？Ｗ？１３逦１逦＊Ｏ４６－；／（？？０１３逡逑逦邋（邋ｉ逦（逦Ｉ邋－邋ｌＹ３ａ８－ｌｔｔＫｌｆｔ７０ｌ３逦逡逑。１！９？邋？逦０３６＾３０邋■逦］逡逑＼逦＼逦／逦Ｉ邋ｖ邋１／．邋？逡逑岕邋＾逦逦逦逦逦邋Ｖ邋．逦晒、逦■逦，逦，逦ｕ逡逑’Ｓ？逦Ｍ２逦４８Ｓ逦＊４逦，逦ｎ＼逦ｋＡＩ逦ｆ？Ｊ逦ＨＭ逡逑ｏｏｏｏｏｏ邋■逦＜，Ｔ２ａｅ－ｚ＾４Ｖ３0ｉ？逡逑ＶＴ３７Ｊ－ｔ／？１？Ｊｒｊ0ｔ４逦ＯＯＯＯＯＯ邋？逦ｉｃｗＭｉｇａｒａ＇逡逑＼逦／逦）逦Ｉ－邋ｊＮＢｉｇ－Ｍｗａｎ逦逡逑Ｉ逦Ｉ逦０，，ａｓ逡逑１逦／ｉ逦／逦Ｉ邋卿■逦＼，＼逦／逦．逡逑、／逦、八ｖ、“逦＿邋＿逦、／Ａｖ逡逑逦

逑（共４条）。ＮｏＶＧＩＩ重组序列有３条，且只有ＧＩＩ．３／ＧＩＩ．６邋—种重组形式。逡逑济南市ＮｏＶ序列中共发现６条重组序列（遗传距离曲线见图１７），且均来逡逑自于２０１３年。其中３条为ＮｏＶＧＩ重组序列，重组类型为ＧＩ．２／ＧＩ．３、ＧＩ．２／ＧＩ．４逡逑和ＧＩ．２／ＧＩ．５，其余３条为ＮｏＶＧＩＩ重组序列，且重组形式全为ＧＩＩ．３／ＧＩＩ．６。重组逡逑序列具体特征见表１５。逡逑０？０００．—逦：邋＼逦ＪｆＢ９－１／Ｇｌ？？１３ｓｃ？ｎｒ＜？＞．ｅ？ｉｒｅＢ逦０邋０００００邋－逦一逦逦邋，＿，邋ＭＳ－７／Ｑ！Ｚ？）１３ｓｃ＊ｎｒ＜Ｍ邋ｉｓ＜Ｒ＞１逡逑ＪＮＳＳ－１０ＩＣ１２Ｗ１Ｓ逦＞０６？０！怎２０１３逡逑－－邋ＪＮ８７－７？１３ＩＺ０１３逡逑０９２０００逦＇逦！逦夬＇逦ｙ逡逑Ｉ邋}0．…ｒ逦１ｊ，ｓｍ0－逦、－＇逦／逡逑娜．＼逦＼」逦聊．＼逦ｙ逡逑３Ｓ９０２0（＾逦（逦，逦，逦＾逦＊２６７９0（＾逦１逦１逦

本文编号：2816180