铝作用于PC12-ApoE4细胞对其Aβ含量和ApoER2等LDLR家族表达的影响

发布时间：2020-09-12 13:22

　　 目的:1.建立稳定表达人源性ApoE4基因的PC12细胞株(PC12-ApoE4细胞)2.探讨铝作用于PC12-ApoE4细胞对其Aβ含量和ApoER2等LDLR家族表达变化的影响方法:1.将携带有人源性ApoE4基因重组慢病毒载体转染PC12细胞株,在荧光显微镜下观察荧光强度,用嘌呤霉素进行筛选,获得ApoE4稳定过表达PC12细胞株(PC12-ApoE4细胞组)和阴性空载体对照PC12细胞株(PC12-NC细胞组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-PCR)分别检测PC12细胞组、PC12-NC细胞组、PC12-ApoE4细胞组的R-ApoE和(或)H-ApoE-FLAG的mRNA相对表达量,以鉴定构建细胞效果。2.实验分为PC12细胞组[包括0μM Al(mal)_3组、100μM Al(mal)_3组、200μM Al(mal)_3组、400μM Al(mal)_3组],PC12-NC细胞组,PC12-ApoE4细胞组[包括ApoE4组、100μM Al(mal)_3+ApoE4组、200μM Al(mal)_3+ApoE4组、400μM Al(mal)_3+ApoE4组]。0μM Al(mal)_3组作为实验对照组。麦芽酚铝溶液处理24h后,采用CCK-8法检测细胞存活率,收集各组细胞。酶联免疫吸附(ELISA)试验检测Aβ_(40)和Aβ_(42)含量,RT-PCR检测APP,ApoER2,LRP1及VLDLRs基因表达,蛋白印迹(western-blot)法检测APP,ApoER2,LRP1及VLDLRs蛋白表达。结果:1.慢病毒转染24h后,PC12细胞组、PC12-NC细胞组、PC12-ApoE4细胞组在显微镜下观察细胞的数量、形态、大小等均无明显差异。PC12-ApoE4细胞组、PC12-NC细胞组荧光显微镜下均可见荧光表达,提示转染成功;PC12细胞组未见荧光表达。PC12细胞组R-ApoE基因、PC12-NC细胞组R-ApoE基因、PC12-ApoE4细胞组H-ApoE-FLAG基因的m RNA的相对表达量的中位数分别为1.00、1.01、148.74,其中,PC12细胞组与PC12-NC细胞组R-ApoE基因的mRNA的相对表达量均低于PC12-ApoE4细胞组H-ApoE-FLAG基因(P0.01)。2.麦芽酚铝染毒24h后,PC12细胞组和PC12-ApoE4细胞组,均随着染毒剂量的增加,细胞数量减少,死亡细胞增多,胞体间的连接减少,细胞间变得松散,贴壁性降低,细胞变圆固缩,胞体有光晕。(1)细胞存活率:麦芽酚铝染毒后,随着染毒剂量的增加,PC12细胞组和PC12-ApoE4细胞组的细胞存活率均降低,均呈剂量-效应关系(P0.01),与0μM剂量组相比较,2种细胞200μM剂量组和400μM剂量组细胞存活率的降低均有统计学意义(P0.01);其中,细胞存活率在染毒剂量及细胞类型的主效应以及交互效应上均有统计学意义(P0.01)。(2)Aβ含量的变化:Aβ总量:与对照组相比较,PC12-NC细胞组、100μMAl(mal)_3组和ApoE4组Aβ总量的变化均无统计学意义(P值分别为0.936,0.385,0.166),其他各染毒组Aβ总量的变化均有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,Aβ总量升高(P0.01);其中,在染毒剂量及细胞类型的主效应及交互效应上均有统计学意义(P0.01)。Aβ_(40)含量:各组Aβ_(40)含量的变化无统计学意义(P=0.073);其中,染毒剂量的主效应具有统计学意义(P=0.022),细胞类型的主效应及染毒剂量与细胞类型的交互效应上均无统计学意义(P=0.214,P=0.395)。Aβ_(42)含量:与对照组相比较,PC12-NC细胞组、100μM Al(mal)_3组和ApoE4组Aβ_(42)含量的变化均无统计学意义(P值分别为0.945,0.339,0.440),其他各染毒组Aβ_(42)含量的变化均有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,Aβ_(42)含量升高(P0.01);其中,在染毒剂量及细胞类型的主效应及交互效应上均有统计学意义(P0.01)。(3)APP基因和蛋白的表达:与对照组相比较,PC12-NC细胞组APP基因和蛋白的表达均无统计学意义(P值分别为0.925,0.722)。基因:与对照组相比较,ApoE4组APP基因的表达升高(P0.01),其他各染毒组均有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,APP基因的表达升高(P0.01);其中,在染毒剂量及细胞类型的主效应有统计学意义(P0.01),交互效应上无统计学意义(P=0.172)。蛋白:与对照组相比较,100μM Al(mal)_3组与ApoE4组均无统计学意义(P值分别为0.077,0.226),其他各染毒组均有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,APP蛋白的表达升高(P0.01);其中,在染毒剂量及细胞类型的主效应有统计学意义(P0.01),交互效应上无统计学意义(P=0.980)。(4)ApoER2基因和蛋白的表达:与对照组相比较,PC12-NC细胞组ApoER2基因和蛋白的表达均无统计学意义(P值分别为0.776,0.092)。基因:与对照组相比较,ApoE4组ApoER2基因的表达降低(P0.01),其他各染毒组均有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,ApoER2基因的表达降低(P0.01):其中,在染毒剂量及细胞类型的主效应有统计学意义(P0.01),交互效应上无统计学意义(P=0.202)。蛋白:与对照组相比较,100μM Al(mal)_3组、200μM Al(mal)_3组和ApoE4组无统计学意义(P值分别为0.436,0.055,0.306),其他各染毒组ApoER2蛋白的表达有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,ApoER2蛋白的表达降低(P0.01);其中,在染毒剂量及细胞类型的主效应及交互效应上均有统计学意义(P值分别为0.00,0.00,0.031)。(5)LRP1基因和蛋白的表达:与对照组相比较,PC12-NC细胞组与ApoE4组LRP1基因和蛋白的表达均无统计学意义(P值分别为0.703,0.524,0.985,0.119)。基因:与对照组相比较,其他各染毒组均有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,LRP1基因的表达降低(P0.01);其中,在染毒剂量及细胞类型的主效应有统计学意义(P0.01),交互效应上无统计学意义(P=0.144)。蛋白:与对照组相比较,100μMAl(mal)_3组无统计学意义(P=0.587),其他各染毒组LRP1蛋白的表达均有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,LRP1蛋白的表达降低(P0.01);其中,在染毒剂量及细胞类型的主效应及交互效应上均有统计学意义(P0.01)。(6)VLDLRs基因和蛋白的表达:与对照组相比较,PC12-NC细胞组与ApoE4组VLDLRs基因和蛋白的表达均无统计学意义(P值分别为0.730,0.148,0.925,0.484)。基因:与对照组相比较,其他各染毒组均有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,VLDLRs基因的表达降低(P0.01);其中,在染毒剂量及细胞类型的主效应有统计学意义(P0.01),交互效应上无统计学意义(P=0.384)。蛋白:与对照组相比较,100μMAl(mal)_3组与100μM Al(mal)_3+ApoE4组均无统计学意义(P值分别为0.271,0.151),其他各染毒组均有统计学意义,表现为随着染毒剂量的增加,VLDLRs蛋白的表达降低(P0.01);其中,在染毒剂量的主效应有统计学意义(P0.01),细胞类型及交互效应上无统计学意义(P值分别为0.245,0.987)。结论:1.成功构建稳定表达人源性ApoE4基因的PC12细胞株。2.麦芽酚铝和ApoE4基因对PC12细胞存活率的影响存在交互作用,ApoE4基因可增强麦芽酚铝对PC12细胞的细胞毒性。3.麦芽酚铝和ApoE4基因对PC12细胞Aβ含量变化的影响存在交互作用,尤其是Aβ_(42)含量的变化,ApoE4基因可增强麦芽酚铝对PC12细胞Aβ含量升高的影响。4.麦芽酚铝和ApoE4基因共同作用对PC12细胞Aβ含量升高的影响可能与二者共同作用对ApoER2及同家族LRP1蛋白的表达下调有关。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【部分图文】：

嘌呤霉素筛选第2天PC12细胞状态（倒置显微镜，×100）

A~F 嘌呤霉素的质量浓度分别为 0、2、4、6、8、10 mg/L。图 2 嘌呤霉素筛选第 3 天 PC12 细胞状态（倒置显微镜，×100）2 细胞数量-时间曲线

PC12细胞数量-时间曲线

【参考文献】

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本文编号：2817677