基于适配体功能化PDMS膜-SERS检测两种食源性致病菌的研究

发布时间：2020-09-14 13:36

　　食源性疾病是威胁全球公共卫生的重要因素,对人类健康造成了严重的影响与危害。其中食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因。传统的食源性致病菌检测方法通常在操作步骤和过程上耗时耗力,且在灵敏度和特异性上都有一定的缺陷。因此,发展更为快捷方便、灵敏度高和特异性好的检测方法对保障食品安全具有重要意义。表面增强拉曼光谱(SERS)是一种具有高灵敏度的无损快速检测技术,基于拉曼“热点”作用,制备具有良好SERS效应的基底是SERS技术发展的关键。选择一种稳定、经济的SERS基底固态支撑材料应用于食源性致病菌的快速检测具有十分重要的意义。本研究以纳米金颗粒作为SERS基底,以适配体作为识别分子。构建基于适配体功能化聚二甲基硅氧烷(PDMS)-SERS检测食源性致病菌的方法,并应用于实际样品检测。主要工作内容包括:首先,构建一种基于适配体功能化PDMS膜“夹心式”检测副溶血性弧菌的方法。首先利用食人鱼溶液(piranha)以及3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对PDMS膜表面进行化学改性,并连接纳米金颗粒制备得到Au-PDMS膜。然后,利用金硫键将适配体固定于Au-PDMS膜形成捕获基底。同时,制备了拉曼信号分子巯基苯甲酸(4-MBA)与副溶血性弧菌适配体同时修饰的纳米金颗粒作为信号分子探针。当靶标存在时,基于适配体与靶标的特异性结合,形成“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构,通过测定拉曼强度从而实现对副溶血性弧菌的检测。结果表明,在最优实验条件下,副溶血性弧菌在1.2×10~2 cfu/mL~1.2×10~6 cfu/m L范围内与4-MBA在1592 cm~(-1)位移处的相对拉曼强度呈现良好的线性关系(y=544.68x-944.13,R~2=0.9948),最低检测限为12 cfu/m L。将该方法应用于实际虾肉样品检测,结果与平板计数法的检测结果无显著差异,表明该方法准确可靠。其次,构建一种基于适配体免固定化Au-PDMS膜检测副溶血性弧菌的方法。为进一步提高检测的便捷性,首先通过PDMS前聚体还原氯金酸制备Au-PDMS膜。接着将半胱胺通过金硫键连接于Au-PDMS膜使其表面带正电荷。然后,将信号分子探针(4-MBA通过金硫键连接适配体修饰的纳米金颗粒)通过静电作用吸附于膜表面。当靶标存在时,基于适配体与靶标的特异性结合,信号分子探针与靶标特异性结合并从膜表面脱落,通过测定拉曼强度变化从而实现对副溶血性弧菌的检测。结果显示,在最优实验条件下,副溶血性弧菌在3.3×10~2 cfu/m L~3.3×10~6cfu/m L范围内和4-MBA在1592 cm~(-1)位移处的相对拉曼强度呈现良好的线性关系(y=650.78x-1063.2,R~2=0.9913),最低检测限为33 cf u/m L。将该方法应用于实际虾肉样品检测,结果与平板计数法检测的结果相比无显著差异,表明该方法准确可靠。最后,构建一种基于适配体功能化PDMS膜同时检测两种致病菌的方法。首先,将两种适配体通过金硫键固定在上述研究制备得到的Au-PDMS膜上,作为固态双重捕获基底。然后,制备4-MBA、尼罗蓝A(NBA)分别修饰的两种信号分子探针。当靶标存在时,基于适配体与靶标的特异性结合,形成双重“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构,通过测定拉曼强度从而实现对双靶标的检测。结果表明,在最优实验条件下,副溶血性弧菌在2.5×10~2 cfu/m L~2.5×10~6 cfu/m L范围内和4-MBA在1592 cm~(-1)位移处的相对拉曼强度呈现良好的线性关系(y=567.24x-485.86,R~2=0.9883),最低检测限为25cfu/m L。鼠伤寒沙门氏菌在4.5×10~2 cfu/m L~4.5×10~6 cfu/mL范围内和NBA在592 cm~(-1)位移处的相对拉曼强度呈现良好的线性关系(y=324.57x-514.03,R~2=0.9892),最低检测限为45 cfu/mL。将该方法应用于实际虾肉样品检测,结果与平板计数法检测的结果相比无显著差异,表明该方法准确可靠。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R155.5
【部分图文】：

原理图,磁珠,金黄色葡萄球菌,原理图

测原理如图 1-1 所示。传统的电学信号作为转换元件因其较用。相较于电化学法，光学法由于更易实现小型化、快速便于致病菌检测的生物传感器的研究应用中。然而这些方法的但抗体的制备需要较高成本且不易储存，使用起来有一定局、新技术被应用于识别原件以及信号转换元件，如寡核苷酸。

谱图,过氧化物模拟酶,鼠伤寒沙门氏菌,比色

基于 ZnFe2O4/rGO 纳米材料作为过氧化物模拟酶对鼠伤寒沙门氏菌的比色.1-2 Schematic of ZnFe2O4/rGO as a peroxidase mimetics for colorimetric detectyphimurium.增强拉曼光谱光谱的概述n 在 1928 年第一次发现了拉曼散射现象[65]，拉曼散射是一种非弹性单色光照射到分子表面时产生散射光，而其中小部分的散射光会改变光谱的波长，从而产生拉曼光谱[66-67]。拉曼光谱与红外光谱光谱[68]，通过分子内官能团的振动产生谱图。由于不同分子有着一种分子具有特定的拉曼光谱，这一特点就是拉曼光谱的指纹特对测得的分子官能团的振动形式产生的拉曼光谱进行对比，达到9]。但是，由于拉曼散射中分子的拉曼散射截面极小，最强的拉曼的千分之几[70-71]，所以拉曼散射在本质上信号强度极其微小，这发展和应用。

表面等离子体共振效应,局域

图 1-3 局域表面等离子体共振效应Fig. 1-3 Illustration of the LSPR effect增强拉曼光谱基底的介绍与应用ERS 研究的重点就是如何提高由表面等离子体共振效应引起的局结构表面具有强大的电场增强位置即 SERS 热点[86]，所以当前 S纳米金属材料作为 SERS 基底展开的[87]。纳米金属材料因其尺有独特的光、电学以及物化性质等特点，成为当今使用最广泛的 SS 增强基底有金属纳米溶胶，例如纳米金颗粒[88]，纳米银颗粒[89金颗粒由于其制备方法简单，性质稳定以及良好的生物相容性[90]广泛的应用在快速检测小分子、金属离子、蛋白质、致病菌、核[91]。Joseph 等[92]利用纳米金、纳米银作为 SERS 基底，分别使用甲基-2-巯基嘧啶和 2-硫尿嘧啶作为信号分子，实现对鼠伤寒沙门 : H7 及金黄色葡萄球菌的同时检测。首先，将 SERS 基底分别与目标菌存在时，相应的拉曼信号分子会与之结合，产生拉曼增强度的检测实现对致病菌的检测。为了进一步提高 SERS 检测的灵

【参考文献】