氯化镧暴露对大鼠血脑屏障细胞旁通透性的影响及分子机制研究

发布时间：2020-09-19 15:33

　　目的:稀土元素(rare earth element,REE)以其独特的物理和化学性质在我国农业、工业和医药等多个领域得到日益广泛的应用,由此越来越多的REE通过不同途径进入环境,并通过呼吸道或食物链进入人体且在组织器官中蓄积。REE非机体必需元素,达到一定剂量后可引起多脏器和多系统的损害。因此,REE引发的环境残留和累积对生态以及人体健康的影响已成为不容忽视的卫生学问题。中枢神经系统(central nervous system,CNS)对于REE的毒性异常敏感,流行病学调查和动物试验研究均显示,REE可影响CNS发育,损害学习与记忆能力。镧是轻稀土元素的代表,其神经发育毒性机制尚不明确,目前认为可能与干扰脑内微量元素(钙和锌)、酶和神经递质系统平衡,以及诱发氧化应激有关。研究表明,镧可以跨越血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)并在脑部蓄积,且以海马和大脑皮质为主。胎儿和生后早期的BBB功能尚不完善,这使得外源性环境毒物进入脑中的机会增大,造成CNS功能障碍。故推测,一方面生后早期未发育成熟的BBB给镧进入脑组织提供了机会;另一方面,镧可能破坏BBB紧密连接(tight junctions,TJs)使其发生渗漏,致使更多的镧进入脑组织而在其中蓄积,影响神经细胞的增殖和分化以及突触结构与功能,造成神经发育障碍。BBB是存在于CNS与系统循环之间的多细胞血管结构,在维持CNS内环境稳态,保证神经元功能正常运行上具有重要作用。BBB的屏障特性主要由脑微血管内皮细胞间的连接复合体决定,包括TJs和粘附连接(adherens junctions,AJs),前者负责限制亲水性分子的细胞旁通透,后者促进TJs的形成与维持。目前认为,细胞旁通透性的高低主要通过连接复合体的变化(连接蛋白的磷酸化、表达和重分布)和细胞骨架重排(actin-myosin收缩)来调控。基质金属蛋白酶(matrix metal oproteinase,MMPs)是一组锌依赖的肽链内切酶,可以直接降解TJ蛋白和血管外基底膜而增高BBB通透性,其中明胶酶(MMP-2和-9)是主要参与者;Rho GTPases成员Rho A与其下游效应器分子ROCK的激活,促进actin-myosin收缩和应力纤维形成,与BBB细胞旁通透性增高密切相关。TJs破坏所致BBB通透性增高是多种重金属(铅、铝、镉)神经毒性的重要靶点,但目前镧对BBB通透性及TJs的影响尚未见报道。本研究通过对大鼠自出生日起至断乳后一个月进行氯化镧(lanthanum chloride,LaCl_3)饮水染毒,建立亚慢性LaCl_3暴露动物模型,利用形态学、生物化学与分子生物学、免疫荧光组织化学等实验技术,探讨LaCl_3对生长发育期大鼠BBB细胞旁通透性的影响,与连接蛋白改变和细胞骨架重排的关联,以及MMP-2/-9和RhoA/ROCK信号通路活化状态在其中起到的作用,为深入阐明镧的神经发育毒性机制、有效预防镧所致认知功能缺陷提供新的线索和实验证据。研究方法:健康成年Wistar大鼠60只(雌雄比例2:1),体重240±10g,由中国医科大学实验动物中心提供。动物室内保持温度22±1℃,相对湿度50±5%,12h昼/夜环境。随机将雌鼠分为对照组和低、中、高剂量染镧组,按照雌雄比例2:1进行交配,次日晨发现阴栓或阴道分泌物镜检查出精子者视为受孕成功,记为妊娠0 d。产仔后对照组孕鼠饮用蒸馏水,染镧组孕鼠分别饮用含0.25%、0.5%和1.0%LaCl_3的蒸馏水溶液。各组仔鼠在断乳前经由母乳染镧,断乳后则通过自由饮用相应浓度的LaCl_3蒸馏水溶液染镧,至断乳后1个月结束,进行各项指标测定。第一部分:采用Evans blue渗透实验定量评价BBB通透性,透射电镜观察BBB超微结构改变,免疫荧光组织化学法与Western blot法检测BBB连接蛋白表达,Real-Time PCR法检测BBB连接蛋白mRNA表达,阐明LaC l_3对仔鼠BBB通透性及连接复合体蛋白表达与mRNA转录的影响;第二部分:采用原位明胶酶谱法检测脑MMP-2/-9活性,Western blot法检测脑MMP-2/-9蛋白表达,Real-Time PCR法检测脑MMP-2/-9及其内源性抑制剂TIMP-2/-9 mRNA表达,探讨MMP-2/-9在LaCl_3诱导的BBB通透性增高和连接蛋白水平下调中的作用;第三部分:通过葡聚糖密度梯度离心提取仔鼠脑微血管;采用Pull-down法检测脑微血管RhoA活性,Western blot法检测脑微血管ROCK1/2、p-MYPT1、p-MLC2和MLC2,以及MLCK蛋白表达,探讨肌球蛋白磷酸化与细胞骨架重排在LaCl_3所致BBB细胞旁通透性增高中的作用。结果:1、LaCl_3暴露对仔鼠血脑屏障通透性和超微结构的影响。LaCl_3处理组大脑半球、皮质和海马中Evans blue渗出量均显著增多,提示LaCl_3暴露使仔鼠血脑屏障通透性增高。LaCl_3暴露致使仔鼠血脑屏障超微结构改变,中剂量组基底膜小部分溶解,TJs致密度降低;高剂量组内皮细胞外围基底膜厚薄不均,有部分溶解,内皮细胞间紧密连接不清晰,致密度下降,星形胶质细胞足突轻度肿胀。2、LaCl_3暴露对仔鼠血脑屏障连接蛋白表达和mRNA转录水平的影响。LaCl_3暴露对仔鼠大脑皮质、海马的TJs蛋白和AJs蛋白表达的影响趋势基本一致,即支架蛋白ZO-1表达无明显改变,跨膜蛋白claudin-5,occludin和VE-cadherin的表达均显著降低;但对其mRNA转录水平却影响不一,与对照组比较,低剂量组大脑皮质occludin和ZO-1 mRNA水平稍有升高但差异不显著,高剂量组大脑皮质和海马claudin-5和VE-cadherin mRNA水平明显下调。3、LaCl_3暴露对仔鼠脑MMP-2/-9活性、表达及抑制剂TIMPs mRNA转录的影响。LaCl_3处理组仔鼠脑MMP-2/-9活性显著增高;大脑皮质和海马MMP-9蛋白表达显著上调,但MMP-2蛋白表达变化不明显。同时,仔鼠大脑皮质和海马Mmp9 mRNA水平显著增高,Timp1 mRNA水平均明显下降,而Mmp2和Timp2 mRNA水平变化均不明显。4、LaCl_3暴露对仔鼠脑微血管RhoA/ROCK信号通路及细胞骨架重排的影响。LaC l_3处理组仔鼠脑微血管GTP-RhoA/Total-Rho A比值显著增大,RhoA活性增高。ROCK1和ROCK2蛋白表达均显著上调,且各组ROCK2相对水平均高于ROCK1,提示LaCl_3暴露可激活RhoA/ROCK信号通路;此外,下游效应分子MYPT1和肌球蛋白MLC2的磷酸化水平均显著增高,MLCK蛋白表达也明显上调,表明ROCK和MLCK共同介导了MLC2的磷酸化,致使细胞骨架重排。结论:1、发育期LaCl_3暴露损害大鼠血脑屏障超微结构,下调连接蛋白occludin蛋白表达,下调claudin-5和VE-cadherin蛋白表达和m RNA转录水平,致使血脑屏障通透性增高。2、发育期LaCl_3暴露增强大鼠脑MMP-2/-9活性,上调MMP-9的蛋白表达与mRNA转录水平,同时下调TIMP-1 mRNA转录水平,改变MMP-9/TIMP-1平衡。3、发育期LaCl_3暴露可激活大鼠脑微血管RhoA/ROCK信号通路并上调Ca~(2+)/CaM依赖的MLCK蛋白表达,致使MLC2磷酸化水平增高,促进肌动蛋白细胞骨架重排。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【部分图文】：

渗出量,仔鼠,大脑半球,定量评价

图 3.1 各组仔鼠脑实质 Evans blue 的渗出量过检测大脑半球、皮质及海马 Evansblue 渗出量，定量评价 BBB通透性改变。lue 渗出量以 μg/g 组织重量表示。图中数据代表 x SD ，n 6，与对照组比较，%组比较，# P<0.05；与 0.5%组比较，& P<0.05。化镧暴露对仔鼠血脑屏障连接蛋白定位与表达的影响疫荧光组织化学法检测仔鼠脑毛细血管连接蛋白的定位与表达。如图示，紧密连接蛋白 claudin-5，occludin，ZO-1 和粘附连接蛋白 VE-cad表达于脑血管内皮细胞，神经细胞无表达，背景色较暗。对照组 4 种均较强，0.25% LaCl3组与对照组比较无明显差别，0.5%和 1.0% -5， occludin 和 VE-cadherin 有不同程度的荧光减弱，但各组 ZO-1 荧明显。

血脑屏障,仔鼠,超微结构,前额叶皮质

13图 3.2 各组仔鼠血脑屏障超微结构透射电镜观察仔鼠脑前额叶皮质血脑屏障毛细血管超微结构，A-D 分别为对照、0.25%、0.5%和 1.0% LaCl3处理组。箭号指示紧密连接，箭头指示基底膜，* 指示星形胶质细胞终足，Scale bar = 1μm。

仔鼠,蛋白,蓝色荧光,大脑皮质

14图 3.3.1 各组仔鼠脑 TJ 蛋白 claudin-5 的定位与表达（200×）免疫荧光组织化学法检测紧密连接蛋白 claudin-5 在仔鼠脑血管的定位与表达。绿色荧光（FITC）强度代表 claudin-5 蛋白在大脑皮质毛细血管的表达，蓝色荧光（DAPI）指示细胞核，Scale bar = 50 μm。

【参考文献】