金刚烷胺的新型酶联免疫吸附方法的建立和胶体金免疫层析检测卡的研发

发布时间：2020-10-11 15:09

　　 金刚烷胺(AMD)是一种人用抗病毒药物,最早用于预防和治疗流感,也曾被用作治疗禽流感、猪流感和猪肠胃炎而广泛应用于畜禽养殖业。然而,过量的AMD会通过食物链在人体内蓄积,对人产生神经毒害并导致严重的病毒耐药性,故我国现已明令禁止其作为兽药使用。本文建立了一种新型酶联免疫吸附方法(ELISA)和一种胶体金免疫层析方法(CG-ICA),实现了对AMD的定性检测。建立的方法准确度高、特异性好、无需仪器,适合基层推广使用。在第二章中,首先合成了AMD半抗原,再通过EDC/NHS介导合成AMD人工抗原。通过质谱和紫外-可见光谱表征,分别确认了半抗原和人工抗原的成功合成。用人工抗原对小鼠进行免疫,并通过间接竞争ELISA对小鼠抗血清进行效价和抑制情况评价。在第三章中,建立了一种基于DNA碱基互补配对和非共价交联胶体(Au NPs)的新型ELISA检测AMD。将AMD单克隆抗体(m Ab)和Primer 1偶联在胶体金表面得到抗体-胶体金-Primer 1新型探针,并用于后续检测。向包被有AMD人工抗原的酶标孔中加入AMD标准品和抗体-胶体金-Primer 1金标探针,然后加入与Primer 1互补的Primer 2进行杂交配对。随后吸取上清中游离的Primer 2,先后向其中加入胶体金和Na Cl溶液,并观察胶体金溶液颜色变化,从而对体系中的AMD进行定性分析。单链DNA能提高胶体金对盐离子的耐受能力,胶体金表面的单链DNA的含量越高,胶体金对盐离子的耐受能力越强。AMD浓度的降低会引起游离Primer 2浓度的降低,使得胶体金对盐离子的耐受能力减弱,使胶体金聚集变蓝,反之胶体金溶液保持红色。当AMD人工抗原包被浓度为1.0μg/m L、Primer 1浓度为0.3μM、AMD抗体标记量为8μg/m L、Primer 2浓度为0.2μM、抗体-胶体金-Primer 1金标复合物重悬液体积为1 m L、显色用胶体金粒径为13 nm、浓度为5.8 n M时,方法灵敏度为0.033μM。本方法与AMD结构类似物和其他常见兽药均不产生交叉反应,特异性良好。在第四章中,研制了一种胶体金免疫层析检测卡对鸡肉中的AMD进行定性检测。制备了金标抗体探针,并在检测线和质控线上分别喷涂AMD人工抗原和羊抗鼠二抗。经优化,最优条件确定为:胶体金标记p H为6.5、抗体标记量为4μg/m L、T线人工抗原浓度为1.5 mg/m L、C线二抗浓度为0.6 mg/m L、结合垫上金标抗体的喷量为6μL/cm。在最优条件下本方法的灵敏度为1.5ng/m L,在实际样本中的检测灵敏度为5μg/kg,与结构类似物和其他常见兽药均不产生交叉反应,特异性良好。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R155.5
【部分图文】：

图 2.1 金刚烷胺人工抗原合成过程Figure 2.1 Synthesis process of AMD artificial antigen2.3.2 金刚烷胺人工抗原的纯化为除去偶联过程中的盐类、未反应的小分子和其他小分子杂质，需对人工抗原进行透析。剪取适当长度截留分子量为 8000~14000 kDa 的透析袋，每袋装入 2 mL液体并用透析夹封口。放入盛有 400 mL透析磷酸盐缓冲液的烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器上，在 4℃条件下，每 6 小时换液一次，透析三天后将袋中液体取出保存。2.3.3 金刚烷胺抗原的表征将所得的半抗原产物取少量配制成适宜浓度，另配制 10 μg/mL AMD 标准品溶液作为参照，将两种样本进行质谱解析，分析谱图。将人工抗原取少量配制成适宜浓度，另配制 10 μg/mL AMD 标准品溶液，1% OVA溶液，对三种样本进行紫外-可见光谱扫描，并分析光谱图。

第二章 金刚烷胺人工抗原合成及单克隆抗体制备2.4 结果与讨论2.4.1 金刚烷胺抗原的鉴定AMD 的相对分子质量为 151.25，质谱解析如图 2.2 A，在（m/z）=152.2 处出现的分子离子峰，符合 AMD M+1 的准分子离子峰。（m/z）=135.1 处出现的分子离子峰推测为 AMD 上的氨基断裂后的桥环结构的特征峰。同理，图 2.2 B中 AMD 半抗原的相对分子质量为 265.2，在谱图上可以看出，（m/z）=266.2 处有较强分子离子峰，（m/z）=152.2 处未出现象征 AMD 结构的分子离子峰，可以推断出 AMD半抗原结构已成功合成。

13图 2.3 AMD-OVA 的紫外-可见光谱Figure 2.3 UV-Vis spectrum characterization of AMD-OVA2.4.2 抗血清的性能评价自二免开始，每次免疫后三天对小鼠断尾取血测效价，以此类推，收集数据绘制免疫应答曲线。由图 2.4和 2.5可知，利用 AMD-BSA 免疫的三只小鼠在五免后效价均严重下降，不足 4000，不能进行后期的细胞融合；利用 AMD-OVA免疫的三只小鼠中虽然 2 号小鼠的抗血清效价较高，但对其进行抑制情况的测定时（图 2.6），加入 100 ng/mL AMD标准品，抑制率仍不足 20%，因此也无法用于单克隆抗体的制备。
【参考文献】

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本文编号：2836760