谷氨酸及其受体在镧所致学习记忆损伤中的作用及相关机制研究

发布时间：2020-10-20 06:21

　　 目的:稀土元素(rare earth element,REEs)包括元素周期表中的镧系元素以及同族的钪和钇共17种元素,可分为以镧(Lanthanum,La)、铈为代表的轻稀土元素和以钇、镥为代表的重稀土元素。REEs可通过呼吸道,消化道等多种途径进入人体并在组织器官中蓄积,引起肝脏、肾脏、免疫、神经和内分泌等多个系统的损害。其中神经系统对REEs的的毒性十分敏感,其损害作用受到了广泛关注。已有流行病学调查显示,稀土矿区儿童的智力发育水平显著低于非稀土区。动物实验也证实REEs可使受试动物神经系统发育障碍、神经行为能力和学习记忆能力下降。由于La的化学性质活泼,在自然界中较为丰富,常被作为研究REEs神经毒性的代表物质。有报道显示稀土矿区儿童的血La含量是对照组儿童的2.26倍。Feng等研究发现大鼠连续6 w经灌胃摄入氯化镧(lanthanum chloride,LaCl3)(2 mg/kg BW/day)后,海马中的 La 含量为0.014 ± 0.007 μg/g。每日在小鸡脑内注射2 mg/kg LaCl3,连续lw可明显损害其长时程记忆过程。体外细胞实验证实La会导致大鼠原代培养神经元的线粒体功能紊乱,星形胶质细胞氧化损伤。以上研究表明镧具有明显的神经毒性,但其所致神经毒作用的确切机制尚不完全明确。谷氨酸(glutamate,Glu)是中枢神经系统中重要的神经递质,对于神经系统发育、突触可塑性维持、神经元回路形成及学习记忆过程起到关键作用。生理状态下Glu的合成、分解、摄取和重吸收是一个动态平衡的过程。Glu主要储存在突触前神经元的囊泡内,当突触前神经元受到刺激时,释放Glu至突触间隙中,与突触后膜上的谷氨酸受体结合并将其激活,由此发挥Glu的神经递质功能。几乎与此同时,突触间隙中多余的Glu会通过“Glu-谷氨酰胺(glutamine,Gln)循环”的方式被重新摄取,经历代谢、释放的过程,再次储存于突触囊泡内,等待下一次兴奋传递的到来。星形胶质细胞在这一循环中发挥了重要作用。当该类细胞受损时,Glu无法被快速摄取,就会造成其在突触间隙中的大量累积,进而过度激活谷氨酸受体,引起兴奋性毒性。N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体是一种离子型谷氨酸受体,与学习和记忆的关系密切。Morris等人的研究发现,缓慢向心室内注入NMDA受体阻滞剂AP5,可明显抑制大鼠海马突触传递长时程增强(Long-term potentiation,LTP)和空间学习记忆能力。LTP是学习记忆的神经基础之一,目前被认为是研究学习与记忆的细胞模型。在正常生理情况下,突触间隙中的Glu会激活NMDA受体,诱导产生LTP,由此实现学习记忆过程。然而在病理情况下,Glu过度激活NMDA受体会造成离子通道持续开发,引发Ca2+大量内流,导致神经细胞死亡基于上述证据,本课题拟通过体内和体外试验,从Glu这一兴奋性神经递质出发,通过研究Glu-Gln循环和Glu的重要受体NMDA受体的表达情况来探索La致大鼠学习记忆损伤的分子生物学机制,为寻找有效干预La所致神经毒作用的分子生物学靶点提供可靠的试验资料与科学依据。研究方法:整体动物试验,由中国医科大学实验动物中心提供的健康成年Wistar大鼠总计80只(雌性:雄性=1:1),体重260±10g,于动物室饲养1w左右以适应周围环境。根据随机化原则将雌性和雄性大鼠按照1:1同笼进行交配,次日清晨发现阴栓或阴道分泌物镜检有精子者记为妊娠第Od并开始染毒,随机将孕鼠分为对照组(饮用蒸馏水);0.125%LaCl3剂量组(饮用含0.125%LaCl3的蒸馏水溶液);0.25%LaCl3剂量组(饮用含0.25%LaCL3的蒸馏水溶液)和0.5%LaCl3剂量组(饮用含0.5%LaCl3的蒸馏水溶液)。孕鼠单笼饲养并自由摄水。子代大鼠在断乳前经吸吮母乳染La,断乳后自由饮水染La,至断乳后1个月。染毒结束后进行各种指标测定。采用电感耦合等离子体质谱法测定大鼠海马及皮质组织中La含量。采用Morris水迷宫和穿梭箱试验测定大鼠的学习记忆能力,采用电生理试验观察大鼠海马CA1区LTP诱导及维持情况,采用透射电子显微镜技术观察大鼠海马神经细胞超微结构变化,采用微透析联合高效液相色谱法检测大鼠海马CA1区细胞外液中Glu及Gln含量,采用Real time PCR法,Western blot法检测大鼠海马及皮质组织中GLAST、GLT-1、GS、PAG、GluNl、GluN2A、GLuN2B的mRNA转录和蛋白表达水平。体外试验使用出生24 h内的wistar大鼠进行大脑皮层原代神经元和星形胶质细胞的联合培养。采用神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)分别鉴定神经元和星形胶质细胞。采用微透析联合高效液相色谱法检测培养液中Glu及Gln含量,采用 Real time PCR 法,Western blot 法检测细胞中 GLAST、GLT-1、GS、PAG、GluN1、GluN2A、GluN2B的mRNA转录和蛋白表达水平,采用TUNEL法测定神经元凋亡率。使用MK801及5,7-二氯犬尿烯酸(5,7-dichlorokynurenic,DDKA)干预后,再次测定神经元相关指标,验证La所致“Glu-Gln循环”障碍引起的NMDA受体过度激活对星形胶质细胞和神经元的不利影响。结果:1.LaCl3暴露可造成大鼠海马及皮质组织中的La蓄积。2.LaCl3对大鼠学习记忆能力的影响:在Morris水迷宫定位航行试验中,随着染La剂量增加,大鼠找到水下平台的潜伏期和游泳距离逐渐增加;与对照组相比,大鼠寻找平台的路径表现出杂乱,无目的性,用时增加,游泳距离增长。在空间探索试验中,染La组大鼠在目标象限的停留时间和穿越目标象限的次数明显低于对照组,搜索平台策略目的性降低,甚至很少进入目标象限。在穿梭箱试验中,染La组大鼠受电击次数、电击时间及主动逃避潜伏期时间均显著高于对照组,学习记忆能力下降。3.在电生理试验中,高频刺激之前,染La组大鼠PS平均幅值略有降低趋势,但没有明显差异;而在高频刺激后,La暴露组大鼠海马CA1 区PS平均幅值增强率明显低于对照组,LTP受到抑制。4.LaCl3对大鼠海马神经元超微结构的影响:对照组大鼠海马神经元细胞结构完整,胞质内细胞器较丰富,核膜边缘光滑连续完整;La处理组大鼠海马神经元中出现细胞核膜界限模糊,线粒体肿胀,细胞器减少。5.La暴露导致体内试验大鼠海马CA1区细胞间隙中,体外星形胶质细胞与神经元共培养的培养液中Glu含量升高。6.体内和体外试验结果均显示La暴露导致谷氨酸转运体GLAST和GLT-1,谷氨酸代谢相关酶GS和PAG的转录及表达水平下调;NMDA受体亚单位GluN1、GluN2A和GluN2B的转录及表达水平上调。7.LaCl3对神经元凋亡率的影响:体外实验中,随着LaCl3处理浓度的增加,神经元细胞凋亡率逐渐增加。8.MK801和DCDA对神经元的保护作用:神经元用MK801和DCDA进行预处理后,可下调NMDA受体亚单位GluN1、GluN2A和GluN2B的转录及表达水平,并使神经元凋亡率降低。结论:1、LaCl3暴露可造成大鼠海马及皮质组织中的La蓄积。2、La可使大鼠的学习记忆能力下降,LTP受到抑制。3、体内、体外试验中,La可使细胞外液中Glu含量升高,“Glu-Gln循环”障碍,NMDA受体过度表达。4、La可明显影响神经元超微结构,并使神经元的凋亡率明显升高。5、使用MK801和DCDA进行预处理,可下调NMDA受体的表达,拮抗La对神经细胞的损伤作用。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【部分图文】：

11.1.1星形胶质细胞的原代培养及鉴定图3.1为星形胶质细胞的鉴定结果。GFAP是星形胶质细胞的特征性蛋白，根据GFAP的免疫组化染色可判断培养的细胞是否为星形胶质细胞。由图3.1可见，大部分细胞的胞浆被染成棕黄色，这是GFAP与其抗体结合着色所致。经计算GFAP细胞阳性率大于95%，故认为该细胞为星形胶质细胞，可用于后续实验。图3.1星形胶质细胞原代培养鉴定（20X）11.1.2神经元细胞的原代培养及鉴定原代培养细胞至第6～7 d，采用免疫细胞荧光方法进行鉴定。神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）高特异性的定位于神经元，故采用NSE一抗对神经元进行鉴定。镜下见大部分细胞被标记为绿色

图3.2神经元的鉴定（20X）Cl3 对星形胶质细胞活力的影响MTT法检测LaCl3 对星形胶质细胞活力的影响。使用不同浓度的养至F3代的星形胶质细胞，24 h后采用MTT法测定细胞存活随着LaCl3 处理浓度的增加，与对照组相比，星形胶质细胞的存有统计学意义（P <0.05）。根据细胞毒性试验要求，实验剂量的半数致死浓度）确定，故本研究选择处理浓度为0，0.125，0.25，0行后续实验。

GS酶活力的影响如图3.8所示，与对照组相比，染La组星形胶质细胞中GS酶活力显著下降，并随染毒剂量的增加而降低(P<0.05)。图3.8 LaCl3 对星形胶质细胞中GS酶活力的影响注：与对照组比较，*P <0.05；与0.125mM LaCl3 组比较，#P <0.05；与0.25mM LaCl3 组比较，&P <0.05。11.6 LaCl3 对星形胶质细胞中GLAST，GLT-1及GS转录及表达水平的影响
【参考文献】

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本文编号：2848341