内质网应激在三丁基锡诱导肝细胞损伤中的机制研究

发布时间：2020-10-23 01:30

　　 目的:三丁基锡(tributyltin,TBT)是一种常见的有机锡类化合物,可作为木材防腐剂、船体防污剂而被广泛使用。作为常见的环境内分泌干扰物,TBT对海洋生物和哺乳动物造成严重危害,主要涉及生殖、神经、免疫、内分泌和肝脏等毒性。作为人体主要的代谢解毒器官,肝脏也是TBT的靶器官。本课题组前期选用人正常肝脏来源的细胞系HL7702细胞,应用基因组学技术对TBT的肝毒性机制进行了系统研究,发现TBT引起的内质网应激可能是TBT致肝毒性的重要原因。在此基础上,本研究将应用高通量的蛋白组学技术对TBT引起肝细胞内质网应激进行深入探索,以期进一步阐明TBT诱导肝细胞损伤的机制。方法:1.用MTT法检测HL7702细胞暴露于不同浓度的TBT(0、2、4、6、8、10μM)2h后细胞增殖活力。2.HL7702细胞暴露于TBT后提取总蛋白,用标记定量蛋白质组i TRAQ?检测所有蛋白的表达水平。3.用Proteinpilot软件进行蛋白质定性和定量分析,筛选出TBT暴露组相对于对照组的差异表达蛋白。4.对蛋白组学中发现的内质网应激反应相关的基因进行实时荧光定量PCR验证。5.运用蛋白免疫印迹技术对蛋白质组学结果中发现的内质网应激反应相关差异表达蛋白进行验证。6.透射电镜下检测不同浓度TBT处理HL7702细胞2h后,细胞超微结构形态的变化。结果:1.TBT暴露影响HL7702细胞的存活和增殖,并且表现出低浓度毒物促进细胞增殖,高浓度毒物抑制细胞增殖的趋势。2.根据蛋白质组实验,细胞暴露于低浓度(2μM)、中浓度(6μM)、高浓度(10μM)的TBT后分别出现349、598、801个差异表达蛋白。3.蛋白质组结果的KEGG通路分析结果表明,内质网应激是TBT肝毒性的主要原因。4.对蛋白质组筛选得到的内质网应激相关基因用q RT-PCR进行验证,变化趋势与蛋白组学结果一致。5.对蛋白质组筛选得到内质网应激相关蛋白用Western Blot进行验证,变化趋势与蛋白组学结果一致。6.电镜下可以看到低浓度TBT处理的实验组细胞核固缩、内质网腔扩张、核糖体脱落,表明内质网应激发生,随着染毒浓度的进一步升高,细胞死亡解体。结论:蛋白质组分析结果表明内质网应激是TBT肝毒性作用的主要原因。ATF6、PERK、IRE1三种感受蛋白介导的未折叠蛋白反应通路全部参与了TBT诱导的内质网应激。
【学位单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【部分图文】：

iTRAQ操作流程图

图 3.1 TBT 对 HL7702 细胞增殖的影响Fig.3.1 Cell viability after HL7702 cells treated with TBT(*P<0.05，**P<0.01) 蛋白组学聚类分析对差异表达的蛋白进行聚类分析，得到一张热图。图中绿色表示各基因表降，红色代表各基因表达水平上升，黑色代表各基因表达水平不变。结果聚类良好，其中中浓度组与高浓度组表达情况接近。

24图 3.2 蛋白聚类分析Fig.3.2 Protein cluster analysis3.3 蛋白质组结果3.3.1 蛋白质组结果总体情况根据可信蛋白筛选标准：Unused > 1.3 且 peptides（肽段数）大于等于 2 条，去除反库数据以及比值为空白的无效值。根据差异表达蛋白筛选标准：Foldchange 为1.5 倍，即倍数变化大于 1.5 或小于 0.67，直接采用两比较组样品几次重复的相对定量值的的平均值进行计算。并且 Dynamics 中进行了动态分析，对同一蛋白在不同比较组中进行了分析，在任意一组中为差异蛋白的蛋白均被列出。最终得到：可信蛋
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本文编号：2852368