NRF2信号通路在锰致TM3细胞氧化损伤中的作用研究

发布时间：2020-10-23 08:07

　　 目的:探讨NRF2信号通路在锰致小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞)损伤中的作用及其可能机制,为锰的生殖毒性机制研究和NRF2信号通路在锰致TM3细胞损伤中的生物学功能以及该通路在疾病中的作用和作用机制提供新的实验依据,为后续的研究和新药的开发,以及疾病的治疗提供新的思路和途径。方法:通过细胞培养技术,将细胞分为以下几组,分别是:1、空白对照组(MnCl_2:0μmol/L,C组),2、低剂量染锰组(MnCl_2:100μmol/L,L组),3、中剂量染锰组(MnCl_2:200μmol/L,M组),4、高剂量染锰组(MnCl_2:300μmol/L,H组),5、激动剂对照组(TBHQ:10μmol/L,TC组),6、激动剂+低剂量组(TBHQ:10μmol/L+MnCl_2:100μmol/L,TL组),7、激动剂+中剂量组(TBHQ:10μmol/L+MnCl_2:200μmol/L,TM组),8、激动剂+高剂量组(TBHQ:10μmol/L+Mncl2:300μmol/L,TH组);9、抑制剂对照组(ATRA:10μmol/L,RC组),10、抑制剂+低剂量组(ATRA:10μmol/L+MnCl_2:100μmol/L,RL组),11、抑制剂+中剂量组(ATRA:10μmol/L+MnCl_2:200umol/L,RM组),12、抑制剂+高剂量组(ATRA:10μmol/L+MnCl_2:300μmol/L,RH组);染锰时间均为24小时。用倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞活力,AnnnexinV/PI双染色法测凋亡率,DCFH-DA探针测ROS水平,TBA法测细胞内MDA含量,Western Blot及RT-Qpcr技术测细胞内NRF2、HO-1、GSTpi、SOD、NQO1等蛋白和基因的表达。结果:1、MTT实验发现在染毒24h、48h和72h三个时间段各剂量组中细胞存活率差异皆有统计学意义(P0.05),且染锰剂量越高,细胞存活率越低。其他各组与对照组相比,随着染锰剂量增加,TM3细胞存活率逐渐降低,差异有统计学意义(P0.05),且具有剂量-效应关系;加抑制剂前后各剂量组相比,加抑制剂组细胞存活率有所降低,差异均有统计学意义(P0.05);与中高剂量组相比,加激活剂同一剂量组细胞存活率有所增加,差异有统计学意义(P0.05),2、在倒置相差显微镜下观察经不同染锰浓度(0μmol/L,100 umol/l,,200μmol/L,300μmol/L)以及经抑制剂ATRA(10μmol/L)、激活剂TBHQ(10μmol/L)预处理TM3细胞1.5h后再染不同浓度锰后,观察TM3细胞形态变化发现C组和RC组细胞贴壁牢固,胞体饱满,分化良好,增殖的细胞相互连接成单层网状,胞质铺展,伸出突起。随着染锰剂量的增加,细胞逐渐回缩变圆,细胞漂浮增多,并逐渐产生细胞碎片。经抑制剂ATRA处理再染毒发现,漂浮细胞更突出,细胞回缩变圆且产生的细胞碎片也增多;C组和激活剂TC组细胞贴壁牢固,分化良好,胞体饱满,增殖的细胞连接成单层网状,胞质铺展,伸出突起,其中TC组细胞状态更好。随着染锰浓度的增加,以上变化更明显,经激动剂处理再染锰发现,细胞浓缩变圆及悬浮细胞不明显,且产生的细胞碎片的量不及未加激动剂组多。3、在双变量流式散点图中显示,与C组相比,其他各组凋亡率升高,差异有统计学意义(P0.05);与未加抑制剂各组相比,加抑制剂同一剂量组凋亡率均升高,差异有统计学意义(P0.05),而加激活剂同一剂量组组凋亡率均降低,差异有统计学意义(P0.05);4、DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平发现不同浓度锰及预染激活剂TBHQ、抑制剂ATRA再染锰作用于TM3细胞后,与C组相比,加激活剂前后各组细胞中的ROS含量均明显增高,其中浓度越高,TM3细胞中ROS含量越高;与未加激活剂各组相比,加激活剂各组ROS含量均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);加抑制剂同一剂量组ROS含量均增高,差异具有统计学意义(P0.05)5、TBA法检测细胞内MDA水平发现不同浓度锰及预染激活剂TBHQ、抑制剂ATRA再染锰作用于TM3细胞后,与C组相比,加激活剂前后各组细胞中的MDA含量均明显增高,且剂量越大,MDA含量越高;与中高剂量组相比,加激活剂同一剂量组MDA含量均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);与低中剂量组相比,加抑制剂同一剂量组MDA含量均明显增高,差异具有统计学意义(P0.05)6、Western Blot技术检测各组Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi蛋白的表达量,与低中高剂量组相比,加抑制剂同一剂量组Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi的表达量都下降,差异均有统计学意义(P0.05),与M、H组相比,TM、TH组Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi的表达量均有所升高(P0.05),差异有统计学意义(P0.05),与TC组相比,TM、TH组Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi等表达量随染锰浓度增加,其表达量亦逐渐增加,差异有统计学意义(P0.05)。7、利用RT-Qpcr方法测定锰对TM3细胞以及抑制剂、激动剂处理后再染锰对TM3细胞中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi等基因mRNA表达的变化,TM3细胞经锰刺激后各组Nrf2mRNA表达量之间的差异均无统计学意义(P0.05);与对照组相比,加激活剂各剂量组HO-1mRNA的表达量均增高,加抑制剂各剂量组HO-1mRNA的表达量有所降低,差异有统计学意义(p0.05);与未加激活剂抑制剂各组相比,加激活剂组组HO-1mRNA的表达量均增加,差异有统计学意义(p0.05),加抑制剂各组HO-1mRNA的表达量均降低,差异有统计学意义(p0.05);NQO1mRNA的表达量只有加抑制剂同一剂量组和低中剂量组相比,加抑制剂各剂量组NQO1mRNA的表达量低于低中剂量组,差异具有统计学意义(p0.05));SODmRNA表达量在加抑制剂各剂量组前后相比,加抑制剂ATRA各剂量组SODmRNA表达量低于未加抑制剂ATRA同一剂量组,差异有统计学意义(p0.05);GSTpimRNA表达量在加激活剂前后相比,加抑制剂后各组GSTpimRNA表达量低于加抑制剂前同一剂量组。差异有统计学意义(p0.05)。加激活剂前后中高剂量组相比,加激活剂后中高剂量组GSTpimRNA表达量高于未加中高剂量组,差异有统计学意义(p0.05)。结论:Nrf2信号通路的激活可能是拮抗锰致TM3细胞氧化损伤的重要机制之一。
【学位单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【部分图文】：

遵义医学院硕士学位论文 朱3 结果3.1 加入激动剂及抑制剂前染锰对 TM3 细胞的影响3.1.1 TM3 细胞生长曲线 数据录入 graphpad 软件，绘制细胞生长曲所示，TM3 细胞随培养时间延长其 OD 值亦逐渐升高，培养 24h 以后进入到长期，60h 以后进入平台期，所以，本次实验细胞均选择培养周期大于 24h 且的细胞进行研究。

MnCl2concentration(umol/L)图 2 不同时间和浓度 Mn2+对 TM3 细胞活力的影响Fig.2 Effect of different time and concentration of Mn2+on the activity of TM3 cells.

MnCl2concentration(umol/L)图 2 不同时间和浓度 Mn2+对 TM3 细胞活力的影响Fig.2 Effect of different time and concentration of Mn2+on the activity of TM3 cel
【参考文献】

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本文编号：2852765